Epirubicin Hydrochloride

研究主题及核心发现 乳腺癌是全球范围内女性中最常见的恶性肿瘤。尽管患者总体生存率已显著提高，但许多肿瘤对治疗仍存在耐药性，因此需要采用新型治疗策略以改善患者预后。本研究评估了患者来源外植体（PDEs）作为乳腺癌（BC）新型临床前研究平台的应用价值，并采用前沿的数字病理学与多免疫荧光技术对终点时肿瘤及间质区域的生物标志物变化进行探究。 发现一：将完整乳腺癌组织片段作为PDEs进行短期体外培养时，其免疫微环境保持完整。 发现二：BC-PDEs对FET化疗方案产生的细胞死亡/增殖反应与乳腺癌患者的无进展生存期显著相关（分别为p=0.012和p=0.0041）； 发现三：而对HER2靶向抗体药物曲妥珠单抗产生的细胞死亡反应则与HER2基因状态显著相关（p=0.018）。 这些研究表明，PDEs平台结合数字病理学技术是一种可靠的临床前研究方法，可用于指导乳腺癌患者对化疗及抗体靶向治疗的临床应答评估。此外，由于BC-PDEs在短期培养中能保持完整的肿瘤组织结构，该平台为靶向肿瘤微环境的抗癌药物进行临床前试验提供了便利条件。一种针对乳腺癌的优化患者来源组织块移植平台可反映临床对化疗及抗体靶向治疗的应答情况研究背景 在女性群体中，乳腺癌是全球范围内最常见的癌症，每年新确诊病例达210万例¹。尽管乳腺癌早期诊断与治疗技术已取得显著进展，使全球范围内5年总生存率达到80%，但乳腺癌仍占女性总体癌症死亡原因的15%。在个体化医疗时代，结合分子生物学与免疫治疗领域的突破性进展，针对不同病理生理学类型的乳腺癌已开发出特异性靶向治疗方案。例如，雌激素依赖性肿瘤可采用选择性雌激素受体调节剂（SERMs）或芳香化酶抑制剂进行治疗；而重组抗体曲妥珠单抗则专用于治疗HER2阳性乳腺癌。对于晚期转移性乳腺癌，可采用靶向血管内皮生长因子（VEGF）的贝伐珠单抗联合紫杉烷类药物进行治疗。此外，目前已有大量临床试验正在开展，旨在评估免疫疗法在乳腺癌患者中的疗效。尽管取得了这些重大进展，但仍有部分肿瘤对治疗具有耐药性。因此，需要开发更精准且更具成本效益的方法，用于在临床相关的时间窗内预测治疗获益，从而改善临床预后。 在临床前研究阶段，评估药物疗效的常见终点指标往往依赖于源自细胞系的异种移植模型，但这些模型并不总能准确预测化合物在临床环境中的疗效⁹。尽管源自患者的异种移植（PDX）小鼠模型在临床应用中具有更高的预测价值，但此类模型成本高昂、传代周期长，且并非所有人类肿瘤都能成功移植至 PDX 小鼠体内；即便成功移植的肿瘤，在连续传代过程中也常会丧失其人类肿瘤的特征。利用源自患者的癌症类器官作为治疗反应预测指标的替代方案已得到广泛探索，该方法在多种实体瘤类型的研究中应用广泛，尤其在乳腺癌研究领域应用颇多。然而，当前的类器官模型存在一个局限性：它们源自解构后的肿瘤组织，因此在忠实地再现患者特异性肿瘤生态系统及微环境方面存在局限性。 为评估治疗反应，研究者采用了新鲜乳腺癌肿瘤器官培养物或乳腺癌组织块的替代性实验方法，但这些方法的成效不一。Cameron 等人最初将乳腺癌组织在体外培养 2–4 个月，期间这些上皮细胞结节性生长物形成了腔面结构；随后的研究发现，延长培养时间会导致上皮岛从组织块远端溢出，而这些上皮岛不含间质成分，这引发了关于在延长培养条件下是否能维持肿瘤微环境的疑问。以往乳腺癌组织块研究的另一项局限性在于：终点分析通常涉及对细胞或生物标志物进行人工评分，而未充分关注药物反应的空间分布。 我们近期报道了非小细胞肺癌（NSCLC）与子宫内膜癌（EC）患者来源的组织块（PDEs）的体外培养方法——该方法涉及对新鲜切除的人体肿瘤三维组织碎片在气液界面条件下进行短期培养。我们利用 NSCLC -PDEs开展的研究证实了这些组织块对化疗药物的反应性与患者临床预后之间存在显著相关性；此外，该平台的临床预测价值也通过其他研究者针对结直肠癌（CRC）开展的类似研究得到了验证。本文中，我们将上述培养方法应用于乳腺癌PDEs（BC-PDEs）的体外培养。与以往采用的长期乳腺癌组织块培养方案不同，我们发现采用这种短期培养方法可完整保留肿瘤-间质的结构特征，且能够对肿瘤区与间质区的药物反应性进行同步评估。我们采用先进的多重免疫荧光（mIF）技术及整片玻片扫描法，并结合数字病理学解决方案，对实验终点时的生物标志物表达情况进行空间谱分析。通过评估BC-PDEs对典型标准治疗方案（5-氟尿嘧啶、表柔比星及多西他赛）以及HER2靶向治疗药物曲妥珠单抗的反应性，我们对这一平台的预测效能进行了验证；我们的数据表明，BC-PDEs的反应性能够稳定反映临床参数。此外，我们首次对BC-PDEs在非肿瘤性间质组织中的治疗反应性进行了评估。研究方法1、患者样本 本研究纳入了55例签署知情同意书的乳腺癌（BC）新近切除肿瘤（直径>25 mm）患者及其术前血液样本，这些患者均在莱斯特格伦菲尔德综合医院（莱斯特大学医院NHS信托基金会， UHL）接受乳腺癌手术治疗。在55例患者中，有6例接受了新辅助内分泌治疗。诊断报告由英国莱斯特大学医院的资深病理医师出具；分子亚型的划分依据以下标准：Luminal A型：ER高表达（7/8）、HER2阴性、Ki67<14%；Luminal B型：ER高表达（7/8）、HER2阴性、Ki67>14%； TNBC 型：ER低表达（0–3）、HER2阴性；HER2富集型：无论ER/PR是否阳性，均判定为HER2阳性。HER2阳性定义为：(1)HER2阳性且 IHC 评分≥3+；(2)HER2阳性且 IHC 评分≥2+，且经FISH检测确认存在HER2基因扩增（该结果已记录于组织病理学报告中）；(3)在可获得数据的情况下，通过原发肿瘤的全外显子组测序分析确认存在HER2基因拷贝数增加。ER、PR及HER2状态均从术后病理报告中提取。 2、患者来源的组织块（PDE）培养3、组织学分析与多重免疫荧光法（mIF）4、图像分析5、细胞凋亡、细胞坏死及细胞增殖的计算6、数据与统计分析7、伦理审查与参与知情同意研究结果1、肿瘤内源性增殖、凋亡与坏死 我们在未经培养的样本中评估了未经治疗的BC-PDEs肿瘤区域在基线状态下的增殖、凋亡及坏死固有水平（图1）。BC-PDEs的增殖率（Ki67阳性）范围为0–40%，肿瘤固有凋亡率（cPARP阳性）范围为0–22%，坏死区域占比范围为0–45%（图1A）。我们进一步探究了新辅助治疗（NT）对肿瘤固有增殖、凋亡及坏死状态的影响；结果显示，NT并未显著改变这些参数（图1B）。与既往研究结果一致，3级肿瘤的肿瘤固有增殖及凋亡水平显著高于2级肿瘤（图1C）；然而，不同分级间的坏死程度无显著差异。不同肿瘤分期间的固有增殖、凋亡或坏死水平亦无显著差异（图1D）。 不同组织学亚型之间的肿瘤增殖与凋亡程度无显著差异（图1E，左图与中图）。然而值得注意的是，与所有其他组织学亚型相比，浸润性黏液癌的内在坏死程度显著较低；而混合型组织学肿瘤及浸润性导管癌的内在坏死程度最高（图1E，右图）。这一现象可能与被归类为“混合型”的肿瘤包含浸润性导管癌（IDCs）有关——既往研究报道约60%的IDC病例存在坏死现象。在分子亚型方面，与Luminal B型及三阴性乳腺癌（TNBCs）相比，Luminal A亚组的内在增殖活性显著较低（图1F左图），这与既往研究结果一致；此外，TNBCs的内在凋亡程度显著高于所有其他分子亚型（图1F中图），且其内在坏死程度最高（图1F右图，但差异未达统计学意义）。这一发现与已发表的研究结果相符：高凋亡率通常与预后较差的肿瘤相关（如TNBCs），而坏死区域在TNBCs中更为常见。 BC-PDE细胞对FET化疗的死亡反应 针对早期及局部晚期乳腺癌的术后辅助治疗通常采用以下5种治疗方案中的1种或多种：内分泌治疗、化疗、放疗、双膦酸盐类药物或曲妥珠单抗。典型化疗方案用于治疗侵袭性乳腺癌的化疗方案均包含蒽环类药物与紫杉类药物；在多数情况下，这些药物被纳入FEC-T治疗方案中，该方案由5-氟尿嘧啶(F)、表柔比星(E)、多西他赛(T)及环磷酰胺(C)组成。值得注意的是，在本研究中，FET治疗方案中未包含环磷酰胺，因为环磷酰胺的细胞毒性作用源于其经肝脏酶促生物活化后转化为活性代谢物4-羟基磷酰胺。为评估化疗药物对BC-PDEs的作用，对46例患者肿瘤组织进行PDE提取，并在存在或不存在FET的条件下将PDEs培养24小时。所有BC-PDEs处理实验均采用基于已发表药代动力学数据推导出的具有药理学相关性的药物浓度。 在评估细胞对FET诱导的死亡反应时，我们将相对于对照组的倍数变化作为有效参数。为探究该参数是否考虑了细胞内固有死亡水平可能产生的影响，我们分析了相对于对照组的细胞死亡倍数变化与FET诱导的细胞死亡率减去对照组细胞死亡率之间的关系。我们发现这两个参数之间存在统计学上显著的正相关性。这一结果证实了“细胞死亡倍数变化诱导参数”能够准确反映相对于对照组的细胞死亡率变化情况；因此，我们后续研究中将重点采用该参数。 针对46例样本，测定了肿瘤细胞凋亡/坏死水平相对于溶媒对照组的倍数变化（图3A）。根据药物诱导的肿瘤细胞凋亡/坏死综合水平，将样本分为低水平（较对照组升高<2.5倍）、中水平（较对照组升高>2.5倍且<5倍）及高水平（较对照组升高≥5倍）三类（图3A）。数据显示PDE治疗诱导的细胞死亡反应范围广泛：43%的病例出现低水平总体细胞死亡，43%出现中水平细胞死亡，13%对FET治疗产生高水平细胞死亡诱导反应。较高分级（图3B）或较高分期（图3C）的肿瘤相较于低分级/低分期肿瘤往往表现出较低水平的FET诱导性细胞凋亡或凋亡/坏死，但这些比较均无统计学意义。这一结果与文献中关于乳腺癌分级/分期与化疗反应相关性的相互矛盾的报道相一致。然而，我们发现，与浸润性导管癌相比，浸润性黏液癌来源的BC-PDEs在药物诱导下引发的肿瘤细胞凋亡及凋亡/坏死总和程度更高（图3D）。这些发现与既往报道相符——即浸润性黏液癌对化疗反应尤为良好，致使黏液池近乎无细胞状态。在分子亚型方面，与Luminal A型及三阴性乳腺癌（TNBC）相比，HER2阳性肿瘤发生的肿瘤细胞凋亡及肿瘤细胞凋亡/坏死总和程度显著较低（图3E）。 我们在终点时进行的mIF分析还可用于区分基质区域与肿瘤区域的药物反应。与肿瘤区域类似，FET治疗诱导了广泛的基质细胞凋亡，其凋亡程度最高可达载体对照组的50倍；其中，Luminal A亚型中观察到的凋亡程度范围最为广泛。基质区域的药物诱导性凋亡与肿瘤区域的药物诱导性凋亡以及肿瘤区域的凋亡/坏死复合指标均呈现强正相关性，这表明FET对靶向作用的细胞类型并无选择性。 BC-PDE对FET化疗方案的反应 已知多西他赛与表柔比星分别可诱导细胞有丝分裂阻滞及抑制DNA复制。因此，我们采用Ki67作为标志物评估了FET诱导的细胞增殖变化。结果显示：与溶媒对照组相比，接受FET治疗后，约63%的BC-PDEs肿瘤区细胞增殖活性降低（图4A），而约61%的BC-PDEs间质区细胞增殖活性降低（图4B）。尽管Ki67在临床上被用作增殖标志物，但由于其存在持续降解现象，该标志物对短期药物治疗的响应可能较慢。为此，我们评估了第二种增殖标志物——Geminin。我们优化了针对细胞角蛋白、Ki67及Geminin的mIF染色检测方法，并发现所有PDEs中Geminin阳性细胞与Ki67阳性细胞之间存在显著正相关性（附加文件8B）；此外，FET诱导的Ki67表达倍数变化与Geminin表达倍数变化之间亦存在显著相关性。总体而言，这些数据表明FET不仅能诱导细胞死亡变化，还可抑制PDEs肿瘤区及间质区的细胞增殖。 BC-PDE对FET化疗的离体反应与患者预后相关 在临床实践中，本研究纳入的患者接受了多种辅助治疗（见附加文件1），因此，对于大多数患者而言，无法直接将体内治疗反应与离体PDEs反应进行相关性分析。此外，鉴于英国乳腺癌（BC）患者的治疗成效显著，本研究中大多数患者在术后存活时间均超过12个月且未出现疾病进展，这使得将PDEs反应与患者临床结局进行比较变得较为困难——这与 NSCLC -PDEs20的研究情况不同。然而，在本研究纳入的46例样本中，有6例患者出现了不良事件（包括死亡或疾病复发）。本研究采用ROC曲线确定对FET治疗产生耐药性或敏感性的临界值，该临界值基于肿瘤细胞凋亡与坏死的联合倍数变化进行计算；所得AUC值为0.7208，由此确定2.331837为最佳截断值（图5A）。随后，将患者样本分为对FET敏感或耐药两组，并利用相应患者的临床资料，探讨了PDE培养中FET敏感性/耐药性与患者无进展生存期（PFS）之间的关系（图5B）。结果显示两者之间存在统计学上显著的相关性（p=0.012）：敏感病例的平均 PFS 时间为30个月，而耐药病例的平均 PFS 时间为23个月。此外，我们还评估了PDE肿瘤增殖（Ki67）对FET治疗的反应与上述结果之间的关系。通过绘制ROC曲线，利用BC-PDEs中经FET治疗后肿瘤Ki67水平相对于溶媒对照组的百分比变化值来确定FET治疗耐药/敏感性的阈值；该ROC曲线的AUC值为0.72（图5C），表明其与定义为敏感或耐药的病例之间存在统计学上显著的相关性（p=0.004）（图5D）。值得注意的是，若采用BC-PDEs中经FET治疗后间质Ki67水平相对于溶媒对照组的百分比变化值来确定FET治疗耐药/敏感性的阈值，则所得ROC曲线的AUC值为0.69（图5E），且该曲线显示在被判定为敏感或耐药的患者之间存在显著相关性（p=0.007）（图5F）。总体而言，这些数据表明，BC-PDEs细胞在体外对FET的死亡及增殖反应可预测乳腺癌患者的短期预后。 BC-PDE对曲妥珠单抗的反应 在既往研究中，我们已证实PDEs在抗体治疗作用下可产生生物学效应，这表明抗体在该活体系统中具有渗透可能性。具体而言，在恶性黑色素瘤来源的PDEs中，我们观察到CD8+细胞毒性T淋巴细胞在抗PD1抗体纳武利尤单抗作用下的迁移现象；而在子宫内膜癌来源的PDEs中，我们观察到帕博利珠单抗诱导的细胞死亡。事实上，早期研究已证实抗体可在20分钟内完全渗透至组织切片。为评估BC-PDE系统在抗体治疗试验中的适用性，我们从40例乳腺癌样本中制备了PDEs，并采用FET+/−（即联合或不联合HER2靶向治疗性抗体曲妥珠单抗）对其进行处理。由于曲妥珠单抗的作用机制仍存在广泛争议，且其作用似乎取决于不同癌症类型间存在的细胞特异性因素，因此目前尚无单一可靠的药效学生物标志物可用于评估曲妥珠单抗的药物结合程度及靶向治疗活性。为此，我们采用曲妥珠单抗诱导的肿瘤细胞死亡率来评估BC-PDEs中的治疗活性——该活性通过计算相对于单纯FET治疗组的细胞凋亡倍数变化以及细胞凋亡/坏死综合比值来确定。采用与上述相同的药物反应分类标准时，57.5%的BC-PDEs表现为低程度的药物诱导性肿瘤细胞凋亡/坏死，25%表现为中等程度的细胞凋亡/坏死，17.5%表现为高程度的药物诱导性肿瘤细胞凋亡/坏死（图6A）。尽管在单纯FET治疗组中仅有4例BC-PDEs的HER2评分为3+，但根据HER2状态的不同，观察到肿瘤细胞凋亡及肿瘤细胞凋亡/坏死程度呈现显著升高趋势（图6B）。此外，与HER2评分较低的2+、1+ 或 0（图 6B）BC-PDEs组相比，HER2评分为3+的BC-PDEs组中肿瘤细胞凋亡水平显著更高，尽管这四个样本之间存在较大的变异度。由于数据存在较高方差，因此将这些数据进一步表示为：与单纯FET治疗组相比，FET联合曲妥珠单抗治疗组中肿瘤细胞凋亡率以及肿瘤细胞凋亡与坏死总发生率的百分比变化。结果显示，在HER2评分≥3+的肿瘤样本中，其肿瘤细胞凋亡率及肿瘤细胞凋亡与坏死总发生率均显著高于HER2评分≤0或≤1+的样本以及HER2评分≤1+的样本。此外，图6B中观察到的高方差现象在本分析中并未出现。在对不同分子亚型进行评估时，根据“方法”部分所述的标准，有7例患者样本被判定为HER2高表达样本。与单纯 TNBC 型及Luminal A型肿瘤相比，加用曲妥珠单抗治疗可显著提高HER2阳性肿瘤中的肿瘤细胞凋亡率及肿瘤细胞凋亡/坏死总发生率（图6C）。 维持BC-PDE免疫微环境 通过短期培养，BC-PDEs 仍保留完整的肿瘤微环境结构，这与我们采用 H&E 染色法进行的评估结果一致。鉴于我们的总体目标之一是应用该 PDE 系统评估对免疫检查点抑制剂的治疗反应，我们进一步通过CD4、CD8、FOXP3 及细胞角蛋白染色对 BC-PDEs 的免疫微环境复杂性进行了分析（图 7A）。我们在来自 8 例患者样本的 100 个外植体中鉴定并表型分析了辅助性 T 细胞（CD4⁺）、调节性 T 细胞（CD4⁺FOXP3⁺）及效应性 T 细胞（CD8⁺）（图 7B）。培养 44 小时后，肿瘤组与间质组中大多数淋巴细胞亚群的组成均无显著差异（图 7C），尽管间质中的 CD4⁺ 细胞数量出现小幅但具有统计学意义的下降。此外，培养的 BC-PDEs 中存在足够数量的免疫细胞，可用于开展功能性分析，例如计算效应性 T 细胞与肿瘤细胞之间的细胞间距离（图 7D）。这些数据表明，BC-PDEs 保留了复杂的间质结构；在对这些免疫细胞的活力及功能进行持续验证的前提下，可确信 BC-PDEs 适用于新型治疗药物（如免疫疗法）的临床前评价。 讨论 目前尚缺乏具有强预测价值、适用于临床转化的、针对患者特征构建的稳健型临床前药物研发模型。尽管 PDX 模型能够预测患者对药物的治疗反应，但其成功率存在差异、成本高昂、培养周期较长，且随着时间推移会丧失人体肿瘤微环境，从而限制了其临床应用价值。在临床试验中，研究发现患者来源的类器官可有效预测患者对治疗的反应。然而，类器官技术依赖于对肿瘤进行解离以及对分离出的肿瘤源性细胞进行三维培养，这一过程破坏了肿瘤微环境；尽管通过添加异源细胞可在一定程度上重建该微环境，但这种解离处理也削弱了此类模型在测试靶向 TME 的药物时的适用性。 相比之下，乳腺组织离体培养作为一种替代性临床前模型系统引起了广泛关注。尽管如文献所述，乳腺癌离体移植模型已在众多既往研究中得到应用，且在某些案例中已证实其临床相关性，但许多其他方法会导致肿瘤组织结构随时间推移而逐渐丧失，从而影响对肿瘤微环境在药物治疗下所发生变化的监测能力。基于这一原因，我们对完整乳腺癌离体培养模型（PDEs）的短期培养条件进行了优化。我们的数据表明，该肿瘤组织结构在长达72小时的培养期内得以维持；尤为重要的是，免疫微环境也得到了保留（图7），这一发现为测试靶向 TME 免疫细胞的免疫检查点抑制剂等药物提供了极具前景的实验基础。 我们的数据表明，BC-PDEs对药物治疗的反应在多个方面反映了临床预期。首先，与临床情况一致，PDEs对FET治疗产生的细胞死亡反应取决于其组织学亚型：与浸润性导管癌相比，临床预后通常更佳的黏液癌在响应FET治疗时会出现显著更多的肿瘤细胞凋亡/坏死；而在分子亚型层面，HER2阳性肿瘤相较于Luminal A型和三阴性乳腺癌（TNBC）所引发的细胞凋亡/坏死程度显著较低。其次，ROC曲线分析与Kaplan–Meier分析揭示了BC-PDEs在患者中对FET与 PFS 治疗所引发的增殖及细胞死亡反应之间存在显著相关性。第三，将HER2拮抗剂曲妥珠单抗加入FET治疗方案后，可显著增强肿瘤细胞死亡率，且该效应与HER2状态相关；此外，HER2高表达的分子亚型相较于 TNBC 型及Luminal A型亚组均表现出显著更高的细胞死亡反应。所有这些数据均表明，临床前在PDEs中观察到的药物反应与临床实际观察到的反应之间存在密切关联。这些数据还表明，该实验平台既可用于评估化疗药物（如FET）的疗效，也可用于评估靶向治疗及抗体导向疗法（如曲妥珠单抗）的疗效。 总体而言，我们的数据表明，BC-PDE平台所反映的药物治疗反应能够准确反映患者在接受标准治疗性化疗药物以及抗体靶向治疗时的临床疗效。我们的数据还显示，BC-PDEs能够保留肿瘤免疫微环境，且可被治疗性抗体靶向作用。这一发现对于将该平台应用于免疫检查点抑制剂的临床前研究尤为鼓舞——目前亟需建立适用于此类药物的合适临床前测试平台。