ADC之偶联技术（二）

2022-09-20

抗体药物偶联物抗体

上篇主要介绍了基于半胱氨酸、赖氨酸的经典偶联技术以及新开发的创新偶联技术。本篇继续对基于羰基、酰胺、叠氮基以及基于其他一些氨基酸官能团的偶联技术做一介绍。羰基(-C(O)R)羰基(醛和酮基)不是天然存在于蛋白质中的，而是要经历与天然蛋白质官能团的完全正交的各种共轭化学反应。通过NNAA的遗传编码或酶法步骤，在单抗上很容易产生羰基。下面介绍下在ADC中应用醛和酮的两个主要的生物偶联反应。肟连接O-烷基羟胺(氨氧基)可以与醛或酮官能团发生特异性反应。氨氧基与任一基团的反应都会产生一种肟键，如果它与酮形成，它是相对稳定的，但如果与醛基团反应，则该键不太稳定。天然抗体不具有醛或酮官能团，Schultzet等人开发了基于以酮基团(对-Ac-苯丙氨酸，p-AcF)为特征的NNAA遗传编码并被Ambrx公司应用。p-AcF可以在单抗中的任何给定位置被工程化，随后的肟连接产生ADC(图1)，应用该技术产生的两款ADC产品ARX788和AGS62P1/ASP1235，已被批准用于临床。图1. 用基因编码的p-ACF与肟基偶联产生ADC另一种将酮安装到抗体中的方法是LegoChem，这也涉及抗体的工程化。在抗体轻链上首次引入 C 端 CAAX 融合后，可以在法尼基转移酶的影响下用合成的氧代异戊二烯衍生物进行随后的烷基化，该过程通常称为异戊二烯化（图2）。同样，ADC的最终生成是通过与适当的O-烷基化羟胺的酮基连接发生的。应用LegoChem技术的ADC也已进入临床，如FS-1502(LCB14-0110)。图2. LegoChem方法Hydrazino-Pictet–Spengler连接肟偶联化学的一个缺点是需要大量过量的试剂和酸性条件(pH 4.5)才能使反应以相当快的速度进行。作为另一种选择，Agarwalet等人开发了Pictet-Spengler反应的变体，在中性pH下与醛反应生成亚胺离子中间体，该中间体重排为含有非常稳定的C-C键的循环产物。基于这一Pictet-Spengler反应，开发了一种基于甲甘氨酸生成酶(FGE)作用下工程半胱氨酸(C端LCTPSR的一部分)被酶氧化成醛的策略。接下来，与细胞毒性有效载荷功能化的N，N-二甲基肼-吲哚试剂孵育会导致稳定的环状偶联物的自发形成(图3)。该方法已经应用于临床药物TRPH-222/CAT-02-106 CAT-02-106。图3. Hydrazino-Pictet–Spengler连接方法酰胺基(-C(O)NHR)到目前为止，酰胺基是蛋白质中存在的最普遍的官能团，因为蛋白质骨架中的所有氨基酸都以这种方式连接。此外，谷氨酰胺和天冬酰胺都具有含酰胺基的侧链。因此，酰胺基似乎是位点特异性偶联的一个不合逻辑的候选者，它的低反应性进一步加强了这一点。然而这一类独特的基于酰胺基的生物偶联能够被天然酶巧妙应用以在含有天然氨基酸(主要是谷氨酰胺)的酰胺基上安装一个官能团。谷氨酰胺的酰胺化谷氨酰胺转氨酶(TGase)广泛存在于脊椎动物、无脊椎动物、植物和微生物中。TGase 可以通过共价结合赖氨酸和谷氨酰胺残基侧链，主要通过催化谷氨酰胺-羧酰胺基团和赖氨酸-氨基之间异肽键的形成，形成分子间和分子内蛋白质交联复合物。在适当的条件下，TGase也可以用来选择性地将赖氨酸功能化的LD或其他具有末端氨基的LD连接到抗体中谷氨酰胺残基的侧链羧胺基团上(图4)。图4. 谷氨酰胺转氨酶作用下赖氨酸功能化的酶结合抗体需要注意的是，单抗中的天然谷氨酰胺通常不是天然TGase的底物。因此，已经采用了各种策略来实现异肽键的形成：(A)通过TGase的突变；(B)通过插入或融合含有C-端肽标签的谷氨酰胺；(C)通过酶去除抗体多糖以暴露Q。例如，Dophen公司开发了一种工程形式的TGase，正在开发针对HER2靶向的DP303c HER2靶向的DP303c，用于治疗实体肿瘤。Rinat/Pfizer的研究人员转而使用天然TGase，结合抗体工程，在不同位置引入TGase识别序列(Q-Tag)。基于LLQGA的C端与抗体重链的融合，Pfizer将靶向TROP-2的ADC药物 PF-06664178 TROP-2的ADC药物 PF-06664178/RN927C推进临床(现已停产)。第三种策略是由Innate Pharma探索的，该策略是基于Schibliet等人最初开发的一种基于酶促抗体脱糖来释放谷氨酰胺HC-Q295的技术。利用该技术的Innate ADC(IPH43)药物目前处于临床前阶段。转肽酶（sortase）的酰胺化反应转肽酶的主要功能是帮助蛋白质附着到细菌细胞壁上，并组装菌毛。转肽酶作用于含有 C 端细胞壁分选信号的分泌蛋白，该信号含有一个五残基识别基序，例如 LPXTG，可以与特定的寡甘氨酸受体底物发生酰胺化反应，从而用受体的寡甘氨酸片段取代LPXTG的末端甘氨酸。这个方法已经用于产生ADC(图5)。例如，NBE Therapeutics公司利用这一方法，通过将LPETG标签融合到重链C-末端，然后与五甘氨酸修饰的细胞毒有效载荷PNU-159,682连接，开发了已经进入临床的ADCs 药物NBE-002。同样，GeneQuantum开发了基于重链 C 端 LPGTG 的GQ-1001药物。图5. 转肽酶介导的Gly5-Linker有效载荷与C端LPXTG标记抗体的偶联叠氮基团(–N3)叠氮基团最为人所知的是其与乙炔基团的“点击反应”中的应用。点击反应也被称为铜催化叠氮-炔环加成反应(CuAAC)，现在被认为是任何成键反应的首选方法。然而，铜也会引起不必要的副反应，如组氨酸或蛋氨酸氧化，由于其毒性性质，在药物制造中很少使用。SPAAC成为了一种强有力的替代品，并且已经开发了多种环辛炔试剂。基因编码氨基酸的无金属点击NNAAs的遗传编码是一种有效的方法，可以将唯一的化学标签安装在单抗的理想位置。Sutro Biophma开发了一个无细胞蛋白表达系统，通过特定位置掺入p-叠氮甲基-L-苯丙氨酸(pAMF)，适合于随后LD点击化学的偶联以此制备ADC(图6)。由于无细胞蛋白表达的效率，进行了位点扫描以确定最佳偶联位置，已被用于各种ADC项目。例如， STRO-001（DAR2 ADC，HC-F404的偶联）、STRO-002（DAR4 ADC， HC-Y180 和 HC-F404 中的偶联）。图6. p-AMF的遗传编码使其能够通过无金属点击化学而特异性的偶联酶修饰的多糖的无金属点击菌株促进的环炔与叠氮化物的环加成反应也被用于GlycoConnect，这是Synaffix开发的一项技术，其核心是将叠氮糖以酶促方式引入到天然抗体的多糖上。抗体首先在UDP 6-叠氮基GalNAc存在下经受内切糖苷酶和糖基转移酶(GalNAc-T) 两种酶的作用，以便将天然糖转化为均质的、截断的和叠氮标记的三糖(图7)。接下来，对叠氮标记的抗体进行LD偶联，以产生均一的ADC。GlycoConnectt技术目前被用于三个临床ADC药物：ADCT-601(ADC Therapeutics)、XMT-1592(Mersana Therapeutics)和MRG004A(Miracogen)。图7. UDP 6-叠氮基GalNAc存在下用内切糖苷和GalNAc-T进行多糖建模，通过连接有效载荷的无金属点击偶联获得均一的ADC用于抗体偶联的其他官能团除了目前在市场和临床ADC中使用的偶联技术。许多下一代偶联方法也正在开发中。苯酚(酪氨酸侧链)广泛的双正交标记策略是基于酪氨酸(Tyr)的苯酚侧链上的选择性化学。酪氨酸出现在蛋白质序列的频率中等 (自然丰度为3.3%)，从而为其独特的苯酚侧链的位点选择性标记提供了机会。尽管酪氨酸通常部分埋藏在蛋白质表面，但它也可以参与氢键，并且由于其氧化还原潜力，可以形成酪氨酸自由基，使电子转移。因此，酪氨酸残基经历了高度多样化的生物修饰，如硝化、氧化、交联、AMP化、卤化或糖基化。Bruinset等人报道了一种最新的方法，该方法基于从特殊设计的酪氨酸部分生成1，2-苯二酮衍生物，然后通过无金属点击环加成的环辛炔环(BCN)来形成稳定的环辛烯键。通过使用mushroom酪氨酸酶选择性地氧化可溶于溶剂的酪氨酸，在抗体表面生成1，2-苯二酮基。甲硫醚(蛋氨酸侧链)蛋氨酸是一种主要负责保护人体免受氧化应激的氨基酸。因此，与其他氨基酸残基相比，其功能化不太可能损害蛋白质的功能。另一个优势是蛋氨酸的丰度较低(约1.8%)，这降低了特定标记的概率。2017年，Lin等人报道了在一系列生物相容反应条件下，通过氧化还原化学选择性标记恶氮杂环类试剂，然后点击化学连接有效载荷，实现了高选择性、快速和稳健的蛋氨酸标记。该技术适用于鉴定整个蛋白质组中的高活性蛋氨酸，也可用于产生ADC，例如选择性结合到工程化的曲妥珠单抗Fab片段上的C-末端蛋氨酸标签。2018年，Taylor等人还报道了一种C末端工程蛋氨酸的选择性反应，该反应基于高价碘试剂的亲电反应性，以及蛋氨酸的侧链SMe基团具有完全化学选择性的点击化学。尽管在概念上两者都非常优雅，但发现所得蛋氨酸偶联物的稳定性一般，需要进一步优化才能成功应用于ADC 领域。咪唑(组氨酸侧链)与蛋氨酸一样，组氨酸是另一种相对较低的天然丰度(2.9%)和低内在亲核性的氨基酸，因此有可能成为一种潜在的适合于抗体位点特异性结合的氨基酸。2017年，Sijbrandi引入了一种新的抗体偶联方法，使用基于阳离子有机铂的连接子随机连接抗体的组氨酸，以稳定地连接LD。基于铂的连接子的结合导致ADC具有不受影响的抗体结合活性，DAR在2.5-2.7范围内，并且大约85%的有效载荷结合到Fc区域。小编小结抗体偶联技术领域正在迅速发展。虽然早期的ADC基于有效载荷连接到赖氨酸或半胱氨酸侧链上，目前仍在该领域占据主导地位。但随着近年来技术的进步，多种创新的偶联技术正在涌现，为ADC的制备拓宽了工具箱，从而有助于该领域向具有更宽的治疗窗口和更好治疗效果的ADC进一步发展，这无疑将是令人兴奋和期待的。参考文献1.Chemical Linkers in Antibody–Drug Conjugates (ADCs).2.Characterization of disulfide bond rebridged Fab–drug conjugates prepared using a dual maleimide pyrrolobenzodiazepine cytotoxic payload.3.Site-specific conjugation of native antibodies using engineered microbial transglutaminases.4.Structure and dynamics of a site-specific labeled Fc fragment with altered effector functions.