Sulfasalazine

前 言 众所周知，药物代谢研究是新药研发中至关重要的一环，它旨在研究药物在机体内发生生物转化的过程，为成药性评价和临床合理用药等提供重要的科学依据。药物代谢过程复杂，涉及机体内多种代谢酶系统和器官，其中肝脏作为药物代谢的主要部位，是常用的研究对象。但对于口服药物，在经吸收入血之前，会先与肠道接触，被肠道内黏液、黏膜及微生物所含的酶作用，这一过程中，肠道菌群所产生的酶起重要作用。近年来，作为机体的“隐形器官”，具有强大代谢能力的肠道菌群对药物的代谢作用研究受到广泛关注。本文主要通过阐述肠道菌群对药物的代谢作用，详细介绍了以肠道菌群为基础建立的体外代谢研究平台。 肠道菌群作用机制及研究方法 肠道菌群是寄居在胃肠道内的微生物群落，包含1000多种不同的细菌[1]，其基因总数是人类自身基因数目的150倍之多[2]。肠道菌群可以参与机体的新陈代谢，从生长发育、免疫调节、吸收、代谢、毒性等多个方面影响宿主的健康状况[3]。 图1. 正常人体肠道菌群的分布[4] 因微环境而异，各个肠段的肠道菌群种类、数量和组成并不一致，沿消化道逐渐增多。一般在小肠近端，由于机械清除作用比较强，不利于细菌定植，因此远端密度大于近端，在结肠达到最高，结肠中细菌种类高达400余种；而粪便主要是反映结肠菌群的情况，微生物在正常粪便中一般约占干重的40%，其中90%以上为活菌，95%以上为专性厌氧菌。成年人的肠道菌群一般以厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门为主，变形菌门、疣微菌门的相对丰度则较低。研究表明，尽管肠道菌群的个体差异较大，但在肠道微生物组中存在一个核心菌群，这种菌群存在于大多数个体中，不随时间推移而变化，形成一个稳定的生态系统，共同维持机体健康[5]。 肠道菌群的作用机制 肠道菌群可通过分泌微生物酶直接参与药物代谢，或通过影响宿主代谢酶的表达来间接作用于药物，从而影响药物的代谢。肠道菌群通过肠道微生物酶的作用所引起的一系列代谢转化反应中，最主要的反应类型为还原反应和水解反应，除此以外还存在官能团转移、裂解反应等。 表1. 肠道菌群代谢反应类型[6] 肠道菌群可表达硝基还原酶，将小檗碱还原为可吸收形式的二氢小檗碱，从而提高小檗碱的生物利用度。肠道菌群通过表达β-葡萄糖醛酸酶水解伊立替康的非活性代谢产物，导致严重的胃肠毒性；其表达羧酸酯酶来水解相对分子质量小的水溶性酯类药物，例如可将阿司匹林水解为水杨酸。除此以外，肠道菌群还可通过亲核取代，催化官能团产生官能团转移反应，从而影响药物活性；肠道菌群也可通过表达裂解酶来影响药物的生物利用度。 肠道菌群的研究方法 目前，对于肠道疾病的研究常采用大小鼠实验动物模型。啮齿类动物个体小、易于操作、成本低，除此以外，近交系小型猪的多项生理、生化指标近似于人类，也被广泛应用于药物研发中。 体外代谢法相较于体内方法，条件更为灵活，有利于控制药物代谢，其研究范围也更广泛，适用于研究灵敏度较低或有毒性的药物，且可以排除体内诸多因素干扰、操作简便、短时间内可大批量操作，适用于临床前高通量筛选，避免了体内代谢研究方法浓度较低、内源性物质干扰较大等缺点。 体外肠道菌群代谢研究的关键是构建与体内真实情况最接近、实验结果重现性好的肠道菌培养模型。近年来，肠道菌群在药物代谢方面的作用备受关注，尤其是普遍难吸收的天然药物，采用药效活性物质于富含肠道菌群的粪便悬浮液在厌氧条件下温孵，是中药成分代谢研究的有效方法之一[7,8]，多项以此方式开展的研究结果表明，肠道菌群对多种天然药物的生物转化起到了关键作用[9]。考虑在不同肠段存在不同的菌群，且代谢能力也不尽相同，冯等[10]应用大鼠肠道菌群体外代谢模型研究了脱氧雪腐镰刀菌烯醇在各肠段的代谢情况，结果表明该药物在小肠中未被代谢，在大肠菌群中有生物转化，其方法不受肠内其他因素的干扰，可单独研究肠道菌群对药物的代谢，但肠道内99%为厌氧菌，细菌培养条件要求高，结果重复性差。 肠道菌群体外代谢体系的建立 近年来，大量围绕肠道菌群的研究将肠道菌群代谢和肠道菌-宿主共代谢的认知提高到前所未有的高度。药明康德DMPK建立了一套针对于肠道菌群体外代谢研究的实验体系，为了与体内菌群尽可能接近可直接采集肠内容物，孵育时需尽可能保证多菌群的生存环境，加入厌氧包降低孵育环境中的氧含量，同时加入氧含量指示剂，更为合理地表征药物在肠道内的代谢水平。 1 商品化合物选择 肠道菌群主要依赖于其分泌的还原酶、水解酶等对药物进行代谢转化[11]。肠道来源的偶氮还原酶是肠道参与药物活化的一类重要还原酶，其广泛存在于细菌中，多种肠道菌比如肠球菌、梭状芽孢杆菌等都具有偶氮还原酶活性，通过该酶可将前药柳氮磺吡啶还原为活性代谢产物5-氨基水杨酸，从而靶向治疗溃疡性结肠炎；肠道菌群中多数革兰氏阳性厚壁菌门具有β-葡萄糖苷酶活性，此类酶通过水解天然产物中的葡萄糖苷类物质，可使其形成有生物活性的苷元，比如芦丁，而芦丁无法以天然形式吸收，需由肠道生物转化为槲皮素才能进入血液循环；肠道菌来源的β-葡萄糖苷酶是虎杖苷的关键代谢酶，其通过表达β-葡萄糖苷酶将虎杖苷去糖基化水解为白藜芦醇，从而发挥疗效[6]。考虑到肠道代谢主要反应类型为还原反应和水解反应，选择以下3种商品化合物进行体系建立。 表2. 商品化合物及其代谢反应类型 2 肠段选择 肠道菌群种类及数量沿消化道逐渐增多：十二指肠的菌落数量较低，种类也较少，以需氧或兼性厌氧菌为主；空肠和回肠中肠道菌群数量及种类有所增多，但仍以需氧菌或兼性厌氧菌为主；盲肠的微生物群较空肠和回肠更为复杂，主要为兼性需氧菌；结肠是肠道菌群主要定植的部位，其微环境适于菌群定植与繁殖，数量及种类最高，且厌氧性细菌占绝对优势[4,5]。考察相应的代谢反应时，选择十二指肠、空肠和回肠、盲肠、结肠来进行。 3 验证结果 将三种药物与不同肠段菌群孵育最长时间至4小时，检测各时间点浓度计算出剩余率（Remaining），结果如下图所示： 图2. 化合物在不同肠段菌群孵育4小时后代谢趋势 从图2可以看出，各化合物在不同肠段孵育4小时后，代谢趋势不一，柳氮磺吡啶和芦丁在远肠段代谢趋势较为明显，虎杖苷在各肠段均有代谢趋势，说明药物在不同肠段的菌群作用下，代谢能力并不完全一致。 图3. 各肠段菌群孵育4小时后不同化合物的代谢趋势 如图３所示，在同一肠段中，不同药物的代谢能力差异明显，可能是相同肠段中针对于不同药物代谢所需的酶含量有一定差别，图2和图3也侧面反映了各肠段菌群的差异性。 图4. 柳氮磺吡啶在不同种属各肠段菌群孵育4小时后的代谢趋势 选取在近肠段和远肠段代谢差异较为明显的柳氮磺吡啶，进行不同种属间的代谢实验。如图4所示，其在不同种属中的相同肠段代谢趋势相近，均在近肠段稳定，远肠段代谢，实验结果也证明该实验体系在小动物不同肠段研究的普适性。 4 结果分析 柳氮磺吡啶在近肠段中较为稳定，而在远肠段存在明显代谢，说明代谢其作用的偶氮还原酶更倾向于在远肠段生成，而柳氮磺吡啶经口服后除部分在空肠吸收，未吸收的药物多进入结肠，由肠道菌群还原为活性物质，临床多用于结肠炎的治疗，可选择其作为远肠段对肠道代谢的研究表征。 虎杖苷在不同肠段均有代谢，考虑到其代谢酶β-葡萄糖苷酶本身在机体内广泛表达，且该酶催化效率高达70%左右，虎杖苷进入机体后代谢它的酶不仅由肠道菌产生，可能是机体与肠道菌群共同作用的结果，可选虎杖苷作为所有肠段代谢的表征。 同样由β-葡萄糖苷酶代谢的芦丁则并非在所有肠段均有代谢，其与柳氮磺吡啶代谢结果更为类似，可能是因为芦丁是非单糖取代的槲皮素类糖苷，肠道本身产生的酶无法对其分解，只有由肠道菌产生的糖苷酶才能将其水解产生苷元，侧面印证了由肠道菌所表达的糖苷酶可能更偏向存在于远肠段，其可为远肠段由肠道菌群表达的酶的代谢表征。 综上所述，各个肠段的代谢酶和发生的反应有差异，所以可根据化合物的作用位点选择合适的肠段内容物进行体外研究。 结 语 经口服方式给药的药物通过肠道菌群代谢是不可避免的，大量的研究也证明药物经肠道菌群的代谢转化对口服药物在体内的暴露、生物利用度和处置起着关键作用，对肠道菌群的体外代谢行为研究可以直观地了解药物可能的代谢变化和作用机制。药明康德DMPK已建立相关的研究平台，以评估药物在动物不同肠段的代谢稳定性和可能的作用机理，在药物微生物学兴起的时代浪潮中，药明康德DMPK积极参与，不断丰富相关的体外实验，在完善完备现有实验体系的同时，也在不断深入探索其他评估体系，为新药研发和临床合理化用药贡献力量。 参考文献： [1]Shu X, et al. Editorial: Can traditional Chinese medicines affect endocrine diseases via effects on the intestinal flora? Front Endocrinol (Lausanne). 2023. [2]Lagier JC, et al, Culture of previously uncultured members of the human gut microbiota by culturomics. Nat Microbiol. 2016. [3] Xie L, et al, Intestinal flora variation reflects the short-term damage of microplastic to the intestinal tract in mice. Ecotoxicol Environ Saf. 2022.  [4] Jandhyala SM, et al, Role of the normal gut microbiota. World J Gastroenterol. 2015  [5] Falony G, Joossens M, Vieira-Silva S, et al. Population-level analysis of gut microbiome variation[J]. Science, 2016, 352(6285):560-564. [6] JIA Yifei, WANG Panpan, CHEN Yijia, YAN Ru. Advances in Gut Microbial Drug Metabolism[J]. Progress in Pharmaceutical Sciences, 2020.  [7] Li Y, Zhou MM, Xing Ln, et al. Advances in study on gut florametabolism of chlorogenic acid [J]. Chin Herb Med, 2015, 46(4):610‒614. [8]  Xie C, Zhong DF, Chen XY. 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11月11日，鲁抗医药发布公告，公司于近日收到国家药品监督管理局核准签发的注射用CIGB-814的《药物临床试验批准通知书》，同意本品进行类风湿关节炎适应症临床试验。 CIGB-814为1类创新药，国内外尚未有同类药品。目前市场上同适应症药品主要为甲氨蝶呤、来氟米特、柳氮磺吡啶、艾拉莫德、羟氯喹、托法替布、巴瑞替尼、依那西普、英利西单抗、阿达木单抗和托珠单抗等。据相关数据显示，2023年国内类风湿性关节炎相关药物市场销售额约为48亿元。 注射用CIGB-814临床拟用于成人活动性类风湿性关节炎。截至目前，鲁抗医药该项目累计研发投入约为8205.65万元人民币。