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肿瘤免疫治疗—三特异性抗体的发展历程
免疫疗法上市批准疫苗基因疗法临床结果
摘要： 尽管单克隆抗体和双特异性抗体在临床取得了成功，但在恶性肿瘤的治疗效果上仍存在局限性，如反应率低、治疗耐药等，这激发了对三特异性抗体(TsAbs)的探索。TsAbs通过三靶点组合和结构优化，进一步提高了安全性和有效性，具有很大的临床潜力。本文综述了TsAbs的发展历史和靶标组合特点。虽然TsAbs在临床应用中还存在很大的挑战，但不可否认的是，TsAbs可能是抗体药物发展的一个突破。
前言
到目前为止，与传统的抗癌治疗策略相比，免疫治疗被认为是最有前途的肿瘤治疗方法，新兴的癌症免疫治疗包括癌症疫苗、细胞治疗、细胞因子治疗、抗体药物、基因治疗等。其中，单克隆抗体(mab)因其特异性结合靶点的能力而成为癌症治疗的关键和有效平台。仅能特异性结合一个靶点的单克隆抗体是第一个获得广泛临床应用的癌症免疫疗法(例如抗PD -1/PD-L1单克隆抗体)。自1975年以来，重组单克隆抗体的发展经历了小鼠单克隆抗体、人小鼠嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体四个阶段。然而，由于肿瘤的复杂发病机制，单抗结合单一靶点往往不足以显示足够的治疗效果。因此，针对两个靶标的双特异性抗体(BsAbs)开始出现。bsAb主要基于基因工程技术，将两种不同抗体的抗原结合位点结合在一起，从而特异性识别两种不同的抗原，达到治疗癌症的目的。与单克隆抗体相比，bsAb具有高特异性和双功能，被认为是抗体工程领域的“第二代抗体”。随着抗体药物的发展，人们发现抗体可以同时靶向三个或三个以上的特异性抗原结合位点，又称为多特异性单克隆抗体(PsMabs)或多特异性抗体(MsAbs)，如三特异性抗体(TsAbs)、四特异性抗体(TetraMabs)等，在癌症治疗领域具有非凡的应用前景。近年来，随着癌症病例数和癌症死亡率的增加，抗体治疗研究的深入，以及免疫治疗的优异疗效，利用单克隆抗体进行免疫治疗越来越受到人们的认可和重视。TsAbs是一种针对肿瘤细胞或免疫效应细胞表面三种不同抗原表位的创新疗法，是癌症治疗领域的创新和重要突破之一。因此，我们重点介绍了TsAbs的发展历史。同时讨论了TsAbs存在的挑战、未来发展方向。
三特异性抗体发展历程
早期研究 ：1960年，Nisonoff等人首先提出了混合特异性抗体的概念，开启了多特异性抗体的探索时代。然而，由于当时的技术瓶颈和临床需求不足，单克隆抗体发展缓慢，无法真正实现药物化。直到1997年，首个用于癌症治疗的单克隆抗体美罗华(Rituximab)被FDA批准上市，抗体药物的研发才正式开始。全球首个双特异性抗体BsAb药物Catumaxomab (靶向EpCAM和CD3)于2009年获得EMA批准。至于三特异性抗体TsAbs，到目前为止还没有相关药物被批准上市。
但事实上，对TsAbs的研究很久以前就开始了。1991年，Gundram Jung等人描述了无Fc结构的双特异性和三特异性抗体片段的构建。同年，Robert F. Graziano开发了一种三特异性抗体偶联物(TAC)，靶向EGFR、HER2和FcγRI (CD64)，并在细胞水平上进行了功能验证。这种TAC将效应细胞介导的肿瘤细胞毒性重定向到表达一种或两种肿瘤抗原的癌细胞，对表达两种抗原的肿瘤细胞具有更好的结合亲和力，并且可以杀死表达EGFR和HER2抗原的肿瘤细胞。早期的研究仍在尝试TsAbs的可能性，具体生物学功能尚未得到深入研究。
前进探索阶段 ：进入21世纪后，TsAbs的发展逐渐加快。各种各样的TsAbs开始出现，它们的生物学功能被测试，并真正尝试将TsAbs应用于肿瘤治疗。2004年，Huang等人构建了一个名为CEA-scTsAb的TsAb(约75 kDa)，它是由antiea (cancer Embryonic Antigen，癌胚抗原)scFv、抗CD3 scFv和抗CD28 VH融合而成，由取自人IgG和人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)恒定区(Fc)片段的多肽连接物分隔。CEA-scTsAb同时桥接肿瘤细胞和T细胞，CD3和CD28的共刺激信号使T细胞活化更加完整和持久，并介导高水平的肿瘤特异性细胞裂解。后来，为了使抗体更好地穿透实体肿瘤，研究小组设计了TR3H (OC scFv /CD3vh/CD28 VH)，使用Fc和HSA片段作为连接体延长重组抗体的半衰期。对卵巢肿瘤细胞和人卵巢癌细胞系SKOV3细胞有明显的杀伤作用。除了通过激活T细胞杀死癌细胞外，还有针对NK细胞和肿瘤细胞设计的TsAbs，增强NK细胞的ADCC功能，从而更有效地杀死肿瘤。随着基础科学和抗体研究的深入，越来越多的学者开始研究TsAbs不同的靶点组合、不同的结构形式、不同的作用机制如何影响细胞的命运和肿瘤的进程。
快速发展阶段 ：从Pubmed的搜索结果可以看出，自2015年以来，关于TsAb的文章增长明显，尤其是在过去的两年里。赛诺菲在《自然癌症》上发表的文章引起轰动，CD38 /CD28/CD3 (SAR442257)介导了很强的肿瘤细胞杀伤作用。与抗-CD38单克隆抗体daratumumab相比，SAR442257在体外对CD38高和CD38低的多发性骨髓瘤细胞的杀伤能力都高出3- 4倍。2020年5月，赛诺菲启动了SAR442257治疗复发难治性多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤的临床研究。此外，还有许多TsAbs已经进入临床阶段。TsAbs正处于快速发展时期，临床前景十分看好。
多样化的设计
当免疫细胞遇到外源性抗原时，它们通过一系列刺激信号被激活，发挥抗肿瘤作用。同时，它们也会通过一系列抑制信号受到抑制，避免自身免疫和组织损伤。这些刺激信号或抑制信号共同形成免疫检查点，调节免疫细胞的功能。许多癌细胞通过免疫检查点信号通路逃避免疫细胞的杀伤，如PD-1/PD-L1抗体，通过缓解癌细胞的免疫逃逸，重建免疫细胞对癌细胞的杀伤作用。抗肿瘤抗体研发的策略主要是针对肿瘤细胞或免疫细胞，增强肿瘤表面抗原识别、增强免疫细胞免疫功能、阻断肿瘤逃逸等，但创新之处在于不同靶点组合的协同作用。与bsAb相比，TsAbs具有更特异的结合位点，这意味着其靶向策略更加灵活。本文总结了目前主要的TsAbs结合域结合形式，为三特异性抗体的开发提供参考。
免疫细胞连接器
T细胞连接器 ：完全激活T细胞需要至少两个信号，第一个信号通过T细胞受体（TCR）和抗原呈递细胞（APC）通过组织相容性复合体（MHC）呈递的肽连接。在T细胞表面，CD3以非共价键与TCR结合，形成TCR/CD3受体复合物，转导TCR识别抗原产生的激活信号，激活T细胞释放颗粒酶和穿孔素，从而有效杀死肿瘤细胞。由于CD3与T细胞的活化密切相关，因此使用人CD3的TCE和肿瘤相关抗原（TAA）进行抗肿瘤治疗的手段已被广泛研究。当在T细胞表面表达的共刺激分子（如CD28亚家族、TNF-TNFR亚家族、诱导型T细胞共刺激因子等）与APC表达的配体结合时，产生第二个T细胞激活信号。共刺激分子的参与使T细胞持续生长。
CD3/IL-15 /TAA: IL-15是一种细胞因子，对NK细胞、NKT细胞的功能非常重要。IL-15在体内的含量很少，但通过与其受体IL-15Ra结合产生具有极高生物效力的复合物，激活对IL-15有反应的细胞，特别是NK细胞，从而促进抗肿瘤功能。有研究人员开发了一种TsAb结合CD3 IL-15-IL- TAA，其通过靶向肿瘤微环境中的CD3激活T细胞，并通过靶向IL-15和IL-15Ra刺激对肿瘤的免疫反应。IL-15和IL-15Ra被巧妙地用于分别取代其中一个抗体结构中的CL和CH1结构域，以避免BsAbs的轻链失配，并避免FC异二聚体形式的重链错配。
NK细胞连接器 ：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）是一种主要由NK细胞介导而成的强效细胞毒性机制。抗体特异性结合肿瘤细IL-15Ra簇，NK细胞表面的Fc受体（FcR）与肿瘤细胞表面抗体结合，NK细胞被激活以杀死肿瘤细胞。NK细胞接合器（NKCE）类似于TCE，一只手臂靶向癌症细胞，一只胳膊靶向NK细胞，外加一个增强NK杀伤功能的靶点，如细胞因子或NK活化受体。
CD16/TAA-1/TAA-2 : 靶向CD16 *CD33* CD123的三特异性抗体，在于抑制急性髓细胞白血病（AML）细胞。这也是第一个报道的NKCE。Miller等人设计了靶向CD16*CD19双特异性抗体和靶向CD16*CD19*CD22的三特异性抗体，这两种抗体都通过CD16直接触发NK细胞活化，显著增加了NK细胞的裂解细胞活性和细胞因子产生。
CD16/IL-15/TAA : 增加ADCC活性的一种方法是用促炎细胞因子如IL-12、IL-15和IL-18刺激NK细胞。与IL-2相反，IL-15抑制IL-2介导的活化诱导的细胞死亡（AICD），不会激活功能性Treg，也不会导致严重的副作用。因此IL-15被更广泛地选择用于TsAbs的设计。靶向CD16* IL-15* CD19的三特异性细胞因子现出促进NK细胞的存活和增殖。此外，CD16* IL-15* CD19可恢复肿瘤诱导的NK细胞功能障碍和抑制作用
三特异性抗体的发展前景与挑战CD33CD123急性髓细胞白血病（AML）CD22
一般来说，双特异性抗体BsAbs只能在三种主要作用机制中的一种或两种之间进行选择：免疫细胞桥接、免疫细胞激活和双重信号通路阻断。然而，TsAbs可以同时实现多种作用机制，在定位癌症细胞的同时激活免疫细胞或阻断免疫检查站，从而延长免疫细胞的作用时间，增加免疫细胞的强度，发挥更好的抗肿瘤作用。尽管如此，TsAbs的发展还没有mAbs和BsAbs那么成熟，它仍然有许多局限性需要更深入地研究和解决。例如（1）TsAbs可以通过高度刺激免疫系统来触发CRS。许多T细胞同时被激活，导致免疫系统细胞过度释放引发炎症的细胞因子。当TsAbs靶向并激活T细胞时，血液肿瘤中CRS的风险已经更大，而实体瘤的剂量可能更高，如何确保这种安全性？（2）在某些情况下，治疗性抗体表现出免疫原性，抗体的给药通常会诱导抗药物抗体（ADAs）的产生，从而抵消药物的治疗效果或导致严重不良事件。（3）TsAbs比mAb和BsAbs更复杂，不同的靶标组合或结构类型影响抗体的理化性质、药理功效和药代动力学特征。与mAb药物相比，多抗药物通常具有蛋白水解、聚集、物理不稳定和低产量的趋势。在工业规模上生产高产量和稳定质量的TsAbs仍然是一个挑战。
到目前为止，还没有TsAb被批准用于临床。并且三特异性抗体的开发充满挑战。然而，许多药物都处于临床前和临床开发阶段。例如，美国食品药品监督管理局授予HPN217“快速通道”称号。未来，除了根据疾病不断优化靶点组合、抗体形式和序列修饰外，TsAbs还可能发展为TetraMab（四特异性抗体）。无论是TsAb还是TetraMab，MsAb作为下一代癌症免疫治疗无疑是一个发展趋势。
参考文献[1] Yao, Y., Y. Hu, and F. Wang, Trispecific antibodies for cancer immunotherapy. Immunology.[2] Tapia-Galisteo A, Compte M, Álvarez-Vallina L, Sanz L. When three is not a crowd: trispecific antibodies for enhanced cancer immunotherapy. Theranostics 2023; 13(3):1028-1041.
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