Melphalan

一分钟速览 本期主要聚焦多肽领域的多项进展。 诺和诺德司美格鲁肽研究显示，特定患者亚组中近九成受试者的肝脂肪含量降至正常范围；国产埃诺格鲁肽公布青少年肥胖Ⅰb期数据，20周平均减重10.4%~12.1%；Zealand分别与勃林格殷格翰、罗氏合作开发的Survodutide和Petrelintide的研究数据公布，均有明显的减重效果；美法仑氟芬胺在脑肿瘤研究中初步证实了药物递送能力，展现出多肽偶联药物的应用潜力。 Wegovy改善肝脂肪堆积，肥胖患者肝脂肪正常化比例近九成 10月1日，诺和诺德公布了司美格鲁肽（Wegovy）在肥胖及肝脏代谢健康方面的新研究结果。 数据显示，在接受司美格鲁肽治疗的特定肥胖患者群体中，约九成受试者的肝脂肪含量降至正常范围。 此次公布的数据来自STEP UP临床研究项目的一项事后探索性分析。研究人员汇总了STEP UP和STEP UP T2D两项Ⅲb期研究共1919名受试者的数据。 在进一步采用磁共振质子密度脂肪分数（MRI-PDFF）测量肝脂肪的55名无糖尿病肥胖受试者中，合并分析的司美格鲁肽治疗组在72周后，平均肝脂肪含量由基线的8.8%下降至3.1%。其中，基线肝脂肪含量超过5%的26名受试者中，有23人在治疗后降至5%以下，占比88.5%。 准确来说，该结果来自特定研究人群，是指这一特定亚组中的23名受试者，而非全部1919名研究参与者。 不过，在肝病治疗方面，诺和诺德此前已通过ESSENCEⅢ期研究评估司美格鲁肽2.4mg在MASH患者中的作用，并取得肝脏组织学改善结果。 此次STEP UP探索性分析则进一步将研究视角延伸至尚未出现明显晚期肝病负担的肥胖人群。 研发进展 | 国产GLP-1埃诺格鲁肽的青少年肥胖Ⅰb期数据公布，20周平均减重10.4%~12.1% 10月8日，先为达生物发布埃诺格鲁肽（Ecnoglutide）青少年肥胖临床研究最新消息，披露了此前在2026年欧洲糖尿病研究协会（EASD）年会上公布的Ⅰb期研究数据。 埃诺格鲁肽是先为达生物开发的创新型GLP-1受体激动剂，通过激活GLP-1受体调节食欲、延缓胃排空并改善葡萄糖代谢，从而发挥体重管理作用。 此次研究共纳入48名12~17岁的肥胖青少年，分别接受1.2 mg、1.8 mg、2.4 mg埃诺格鲁肽或安慰剂治疗，主要评估药物在青少年人群中的安全性和耐受性，并观察体重、BMI等指标变化。 治疗20周后，埃诺格鲁肽各剂量组平均体重降幅为10.4%~12.1%，BMI平均下降11.2%~12.6%，而安慰剂组BMI基本没有变化。 安全性方面，研究未报告治疗相关严重不良事件，常见不良反应包括恶心、腹泻和呕吐，与GLP-1受体激动剂已知的胃肠道不良反应特征基本一致。 研发进展 | 双靶点GLP-1Zealand与勃林格殷格翰的SurvodutideⅢ期达到主要终点，76周平均减重13.1% 10月1日，丹麦生物制药公司Zealand Pharma公布了与勃林格殷格翰合作开发的GLP-1/胰高血糖素受体双重激动剂Survodutide的Ⅲ期临床研究结果。 Survodutide是一款每周一次皮下注射的创新型多肽药物，可同时激活GLP-1受体和胰高血糖素受体。 GLP-1受体激动作用主要帮助调节食欲、减少食物摄入并改善血糖，而胰高血糖素受体激动作用则被认为可能通过影响能量代谢等途径进一步促进体重下降。两种机制相结合，是Survodutide区别于单靶点GLP-1药物的重要特点。 在针对超重或肥胖合并2型糖尿病患者的SYNCHRONIZE-2研究中，Survodutide成功达到共同主要终点。治疗76周后，表现最佳的剂量组平均体重下降13.1%，安慰剂组下降3.1%，同时观察到血糖控制改善。 此外，79.3%的治疗组患者实现至少5%的体重下降，而安慰剂组这一比例为32.7%。 研发进展 | 胰淀素多肽Zealand与罗氏的胰淀素多肽Petrelintide的Ⅱ期数据公布，最高剂量组28周平均减重9.2% 10月7日，Zealand Pharma公布了与罗氏合作开发的Petrelintide的Ⅱb期临床结果。 Petrelintide是一款长效胰淀素（Amylin）类似物，通过模拟人体天然胰淀素的作用，增强饱腹感、调节胃排空和食物摄入，从而帮助控制体重。 与司美格鲁肽、替尔泊肽等GLP-1相关药物相比，Amylin类药物作用于不同的激素信号通路。 在针对超重或肥胖合并2型糖尿病患者的ZUPREME-2研究中，Petrelintide达到主要终点，治疗28周后，Petrelintide各剂量组患者的平均体重降幅为7.4%~9.2%，其中平均减重幅度最大的剂量组达到9.2%，安慰剂组平均减重2.0%。 与此同时，该药还表现出一定的血糖改善作用，且因胃肠道不良事件而停药的比例较低。 这一结果进一步验证了Amylin类多肽的减重潜力。 目前，Zealand Pharma与罗氏已启动Petrelintide全球Ⅲa期临床开发计划，涉及ZUPREME-3、ZUPREME-4和ZUPREME-5三项研究，预计总共招募约7000名受试者，进一步评估其在不同肥胖及代谢风险人群中的疗效与安全性。 临床突破 | 多肽偶联药物美法仑氟芬胺的脑肿瘤研究初步数据公布，展现血脑屏障穿透潜力 10月9日，瑞典生物制药公司Oncopeptides公布了旗下多肽偶联药物（PDC）美法仑氟芬胺（Melphalan flufenamide，简称Melflufen）在胶质母细胞瘤临床研究中的初步结果。 美法仑氟芬胺是一款具有烷化作用的多肽偶联抗肿瘤药物，商品名为Pepaxti，已在欧盟获批用于特定复发或难治性多发性骨髓瘤患者。 与传统化疗药物不同，美法仑氟芬胺具有较强的脂溶性，能够较快穿过细胞膜进入细胞，并在细胞内经肽酶作用释放具有细胞毒性的美法仑，从而发挥抗肿瘤作用。 Oncopeptides此次尝试将其应用于胶质母细胞瘤，希望利用其药物递送特性，探索治疗这一侵袭性脑肿瘤的可能性。 在名为INSULA的探索性研究中，首批3名患者的肿瘤组织均检测到活性药物成分，初步证实该药物能够进入人体脑肿瘤组织。 胶质母细胞瘤是侵袭性较强的原发性脑肿瘤之一，治疗难度较高。血脑屏障能够保护中枢神经系统，但同时也限制了许多抗肿瘤药物进入脑组织，是脑肿瘤药物研发面临的重要障碍。 此次研究的意义在于，通过人体肿瘤组织检测，为美法仑氟芬胺拓展脑肿瘤治疗提供了药物递送方面的早期证据，不过目前尚不能证明其具有明确的抗肿瘤疗效。 参考资料： [1]https://www.novonordisk.com/news-and-media/news-and-ir-materials/news-details.html [2]https://www.sciwind.com.cn/portal/index/newsdetail/id/151/category_id/5.html [3]https://www.boehringer-ingelheim.com/jp/press-26-1005 [4]https://www.globenewswire.com/news-release/2026/10/07/3376750/0/en/zealand-pharma-announces-positive-phase-2-zupreme-2-topline-results-for-amylin-analog-petrelintide-in-people-with-overweight-or-obesity-and-type-2-diabetes.html [5]https://oncopeptides.com/press-releases/oncopeptides-confirms-blood-brain-barrier-penetration-based-on-data-from-first-patients-in-glioblastoma-window-of-opportunity-study END

“101计划”核心教材 化学领域 化学生物学(上 顾 问 谭蔚泓 主 编 刘 磊 陈 中国教育出版传煤集团 高等教育出版社 “101计划”核心教材 化学领域 化学生物学(上册 主 编 刘 磊 陈 中国教育出版传媒集团 高等教育出版社 内容提要 本书为化学“101计划”核心教材。全书共十八章，分上、中、下三册出版， 每册各六章。其中，上册以生物大分子的分子基础为核心，阐述核酸、蛋白质和多 肽、糖、脂质、天然产物、生物无机化学；中册以化学生物学方法与技术为核心， 阐述生物分子识别与互作、面向生命的化学反应、核酸的关键化学生物学技术、基 于质谱的蛋白质组学、生物分子成像、化学遗传学等化学生物学核心技术；下册以 化学生物学的概念拓展及真实场景应用为核心，阐述生物大分子的进化、生命过程 的化学调控、疾病分型与诊断、小分子药物、生物技术药物、生物催化与合成生物 学等内容。本书充分体现了化学与生命科学、医学、药学等学科深度交叉融合的特 点，是一本内容丰富、适合不同阶段本科生及研究生教学、兼具高覆盖度与挑战性 的教材。 本书配套有《化学生物学动态电子教案》,可供教师参考使用。 本书可作为高等学校化学类专业化学生物学课程教材，亦可供其他相关专业 参考。 图书在版编目( CIP) 数据 化学生物学.上册/刘磊，陈鹏主编.--北京: 高等教育出版社，2025.9.-- ISBN 978-7-04-065665-7 I.Q5 中国国家版本馆CIP数据核字第20255KB457号 HUAXUE 自2023年4月启动以来，化学“101计划”以高质量化学学科人才培养体系构建和拔尖创新 人才培养为目标，从化学学科全局视野系统性重构化学拔尖创新人才培养的核心知识框架，以核 心课程建设(含理论课和实验课)推动化学专业课程体系改革，以教案、教材建设推动教学内容 迭代，以数字化资源建设推动教学方式转变，以课堂观察、名师引领、研修培训推动课堂教学质 量提升，着力建设一流核心课程体系和一流核心教材体系，培育高水平师资团队，探索构建具有 中国特色的化学拔尖创新人才高质量自主培养体系。 教材是教师教学和学生学习的主要依据，是培根铸魂、启智增慧的核心载体，是践行拔尖创 新人才自主培养的有力支撑，出版一套高水平核心教材是化学“101计划”的重点任务之一。为 此，化学“101计划”汇聚国内化学领域具有丰富教学经验与顶尖学术水平的教师和专家团队，以 普通化学、无机化学、有机化学、分析化学、物理化学、结构化学、高分子化学与物理、化学生 物学、基础化学实验、合成化学实验、化学测量学实验和化学生物学实验12门核心课程的知识体 系建设成果为基础，充分借鉴国内外先进课程与优秀教材建设经验，以学生的能力培养为导向， 在纸质教材、电子教案、数字资源等方面进行了多角度、多层次的探索，着力构建“世界一流、 中国特色、101风格”的化学核心教材体系。 系列教材总体遵循思政元素的思想性、知识体系的系统性、学术案例的前沿性、能力培养的 引导性和呈现方式的融合性五大原则。在知识内容的分类上，理论课程注重“守正”,按照二级学 科设置，实验课程突出“创新”,促进二级学科的交叉；在知识内容的选择上，兼顾基础和前沿， 注重提升内容的创新性、高阶性和挑战度，并选取有代表性的中国优秀科研成果作为案例，有机 融入思政元素，挖掘知识的育人内涵；在编排设计上，融入现代教育理念和教学方法，探索内容 铺排和呈现方式的创新，注重激发学生学习主动性，培养学生自主学习、分析和解决问题的综合 能力。 系列教材采用适应专业知识快速更新的融合式编写模式，以边栏拓展阅读等形式将纸质教材 与数字资源相链接，拓展教材内容；同时配套翻译国外优秀教材，与系列新编教材相辅相成；此 外，配套出版电子教案集。这些探索和实践分别从“教什么”和“怎么教”两条逻辑，融合教学 新理念、新内容和新方法，形成以纸质教材为核心、数字资源为辅助的新形态教材体系。 参与编写系列教材的编委和撰稿人主要是来自30所“化学拔尖学生培养计划2.0基地”获批 高校从事教学和科研的教师、专家和学者，尽管工作任务繁重，但他们仍然抽出大量的宝贵时间， 秉持严谨认真的科学态度和精益求精的工作精神，保质保量地完成了系列教材的编写工作。在此， 我表示衷心的感谢。此外，多位院士和资深专家对系列教材的编写和审订提供了诸多宝贵意见和 建议，对教材的质量进行了严格把关，感谢他们的悉心指导和支持。同时我也非常感谢各参与出 版社的有关领导和编辑们在系列教材出版过程中的辛勤付出。 作为新时代化学领域首次有组织、系统性建设核心教材体系的集体探索，这套教材是所有指 导专家、编委、撰稿人和编辑同仁们集体的智慧结晶和劳动成果，也是传递化学“101计划”改 Ⅱ I 总序 革理念和思路的重要载体，期盼能对广大读者有所裨益。“合抱之木，生于毫末；九层之台，起于 累土。”系列教材的出版绝非终点，而是起点。真诚希望广大读者在使用过程中提出宝贵意见和建 议，以便我们今后修订，使之不断完善，为我国化学拔尖创新人才培养提供启示与支撑。 机 化学“101计划”牵头人 中国科学院院士 2024年10月于中山大学 序 当人类对生命的探索从宏观描摹深入分子解构，从现象解析迈向精准调控，化学生物 学——这门化学与生物学深度交融的前沿学科，已成为解锁生命奥秘的关键密钥。它以化学之 “眼”洞察生命活动规律，以化学之“手”实现生物功能创制，在分子尺度搭建起连接基础科 学与生命健康的桥梁。 这一学科的勃兴，源于传统学科融合的时代必然：有机化学、无机化学、分析化学与物理化 学为解析生物分子结构与功能奠定了坚实基础；分子生物学、分子医学和药学的快速发展则对化 学工具提出迫切需求。这种交叉范式不仅为破解生命科学中的复杂谜题提供了全新路径，更贯穿 “生物大分子解析—分子识别干预—疾病机制探索—药物临床转化”的全链条，在医药健康、农业 生态、能源环境等领域彰显革命性价值。 我国化学生物学自21世纪初形成独立学科体系以来，始终受到学术界、工业界与教育界的高 度关注与鼎力支持。国家战略引领下的学科布局日趋完善——国家自然科学基金委两期重大研究 计划的启动，为体系建设与人才梯队筑牢根基。然而，面对跨学科研究的迅猛发展，教材建设亟 须突破传统藩篱：既要平衡知识的系统性与前沿性，又要融通理论的深度与应用的广度。在化学 本科教育教学改革试点工作计划(“101计划”)将化学生物学列为核心课程的关键节点，这部奠基 性教材的诞生恰逢其时。 欣慰所见，本教材由清华大学刘磊教授、北京大学陈鹏教授领衔，集全国多所高校、科研院 所顶尖学者及优秀教师智慧，淬炼多年教学科研精髓而成。其内容体系建构彰显三大特色： (1) 逻辑严密的三维架构。 上册聚焦分子基础(生物大分子结构与功能),中册解析关键技术 (标记示踪、合成调控、计算模拟),下册拓展应用实践(疾病诊疗、药物研发、合成生物学),三 册教材内容层次分明、逻辑严密。 ( 2) 知行合一 的育人理念。以经典理论筑牢根基，以前沿案例激发创新(如PROTAC技术、 CRISPR-Cas 定向编辑),通过近百个应用实例，生动诠释“化学工具驱动生物发现”的学科内核， 引导学生关注学科融合产生的创新机遇。 (3)前瞻引领的内容设计。探讨AI 驱动的靶点预测、酶及药物设计等突破性方向，展望各领 域前沿，激发批判性思维。这种“分子基础—工具方法—应用实践”三位一体的立体化内容架构， 将为化学生物学学习者铺设系统认知的阶梯，为化学生物学领域的研究者提供跨界创新的镜鉴。 衷心感谢全体编者的辛勤付出!期待这部凝聚中国智慧的《化学生物学》教材，助力培养更 多“明分子之理、创生命之新”的卓越人才，为我国在生物医药领域的原始创新注入不竭动力。 化学“101计划”指导专家 中国科学院院士 2025年8月于杭州 前 言 2023年4月教育部启动基础学科系列“101计划”,以教材、课程、教师和实践项目等要素为 突破口，提升基础学科拔尖学生自主培养质量，带动实现高等教育的变革性发展。培养具备跨学 科知识和创新能力的复合型人才，已然成为推动基础学科建设和科技创新的重要战略需求。化学 生物学是化学“101计划”规划的重要核心课程之一。作为跨学科的研究领域，化学生物学致力于 利用化学的方法和工具来研究生物体系中的分子机制和生物分子的相互作用。它的兴起与发展不 仅改变了传统生物学和化学学科的研究方法，也为许多前沿复杂问题提供了新的解决思路。本书 旨在为读者提供系统、深入的理论指导和实践方法，为读者搭建通向化学生物学领域的桥梁，以 适应新形势下对化学生物学人才培养的要求。 化学生物学的起源可追溯到20世纪初，科学家在分子水平上探讨核酸、蛋白质等生物大分子 的结构与功能时，化学和生物学的交汇逐渐显现。随着合成化学、分子生物学及生物技术的发展， 研究者逐步认识到，通过化学合成手段可以研究和调控生物体系中的分子活动，化学生物学的应 用也逐步向药物发现、疾病诊疗等领域拓展。在分子识别与分子靶向、生物大分子与小分子的相 互作用、化学探针与功能筛选、合成生物学与代谢工程等多个研究领域取得了重要突破，并成为 现代生物医学、药物开发、环境科学等多个领域的重要工具和推动力量。 在此背景下，为更好地开展“101计划”《化学生物学》教材建设，编者对国内外高校化学生 物学课程教学内容和教材进行了调研分析，并召集参与化学生物学课程建设的“基础学科拔尖学 生培养计划2.0基地”高校的教师进行了研讨。根据研讨情况，编者构建了“101计划”《化学生物 学》教材的内容框架。从生命体系的分子基础出发，梳理化学生物学的核心技术，进而介绍化学 生物学的拓展及应用，力求建立从基础到前沿，从理论到应用的化学生物学知识体系与教学框架， 充分体现化学与生物学、医学、药学等多学科的交叉融合特点，在内容深度、实践导向等方面展 示出创新特色。本书内容的设计特点包括： (1)构筑扎实的知识体系。从化学角度出发，讲解生物大分子(如核酸、蛋白质、糖、脂质 等)的化学结构、功能及其相互作用。帮助读者运用化学原理解析生物分子的结构与功能关系， 掌握化学生物学的分子基础。 (2) 重视关键核心技术。 酶学与生物正交反应、基因组学与蛋白质组学、分子成像、化学遗 传学等是开展化学生物学研究不可或缺的方法工具。本书详细讨论了这些工具的发现历史与研究 进展，帮助读者理解技术背后的基本原理与科学发现，培养跨学科视野和创新思维。 (3)培养分析与应用能力。 将理论、技术工具与前沿研究相结合，面向国家需求、药物研发 和人民健康，引导读者了解化学生物学在精准医疗与个性化药物、人工智能与药物发现、代谢组 学和系统生物学，以及环境与能源应用等前沿热点领域中的应用，拓宽学术志趣，更好服务国家 与社会发展。 (4)强调多学科之间的交融。 化学生物学拓宽了学科的边界，为解决一系列复杂的生物学问 题提供了全新的思路和方法。本书注重将知识概念、研究内容及代表性案例，以“知识盒子”等 Ⅱ I 前言 不同形式呈现，帮助读者熟悉相关研究全景，形成学科的核心脉络。 (5)塑造科学品格。注重引领正确的科学价值观，培养严谨求实的科学态度、求真创新的学 术理念、独立思辨的研究能力，增强责任担当。 希望读者通过学习本书，不仅能够掌握化学生物学跨学科的理论知识，还能够拓宽学术视野， 提升多角度思考、分析并解决问题的能力，为今后的学习、工作奠定坚实基础，为未来的职业选 择拓展空间。 本书汇聚了来自多所高校、科研院所教师的集体智慧。“101计划”化学生物学课程责任专家 谭蔚泓院士为顾问，把握本书的方向与框架；李艳梅教授、周德敏教授为主审专家；“101计划” 化学生物学课程负责人刘磊教授、陈鹏教授负责本书的总体设计与协调、内容审定与修改等工作。 具体的编写分工如下： 第一章 核酸：周传政(南开大学),田油(武汉大学),汤新景(北京大学)。 第二章 蛋白质和多肽：郑基深(中国科学技术大学),曹婵(南开大学),何春茂(华南理 工大学),陈永湘(清华大学),俞玉明(新疆大学)。 第三章 糖：王平(上海交通大学),董胜伟(北京大学),谢然(南京大学)。 第四章 脂质：林世贤(浙江大学),瑕瑜(清华大学),邹贻龙(西湖大学),张帅(华中农 业大学),赵雪(内蒙古大学),赵红霞(浙江工业大学)。 第五章 天然产物：张琪(复旦大学),董世辉(兰州大学),李付璋(复旦大学),罗尚文 (兰州大学),杨彦龙(兰州大学)。 第六章 生物无机化学：谭彩萍(中山大学)。 第七章 生物分子识别与互作：冯玲玲(华中师范大学),王雪强(湖南大学),宋璐(北京 航空航天大学),刘睿(北京师范大学),孙耀(华中农业大学),卢忠林(北京师范大学)。 第八章 面向生命的化学反应：季者(北京大学),樊新元(北京大学),陈鹏(北京大学)。 第九章 核酸的关键化学生物学技术：杨朝勇(厦门大学),季泉江(上海科技大学),汪铭 (中国科学院化学研究所),林世超(厦门大学)。 第十章 基于质谱的蛋白质组学：秦为(清华大学),谢然(南京大学),邹鹏(北京大学)。 第十一章 生物分子成像：高锦豪(厦门大学),贺晓鹏(华东理工大学),陈知行(北京大 学),袁林(湖南大学),林泓域(厦门大学),任天兵(湖南大学)。 第十二章 化学遗传学：杨财广(中国科学院上海药物研究所),董泽(国科大杭州高等研究 院),黄悦(中国科学院上海药物研究所)。 第十三章 生物大分子的进化：王江云(中国科学院生物物理研究所),曹耀中(中国科学院 生物物理研究所),林世贤(浙江大学),王杰(南方科技大学),向宇(清华大学),司同(中国 科学院深圳先进技术研究院)。 第十四章 生命过程的化学调控：何薇薇(华东理工大学),刘聪(中国科学院上海有机化学 研究所),许代超(中国科学院上海有机化学研究所),王婧(中国科学院上海有机化学研究所)。 第十五章 疾病分型与诊断：韩达(中国科学院杭州医学研究所),杨洋(上海交通大学), 郭媛(西北大学),施茜(上海交通大学),张朝(上海交通大学)。 第十六章 小分子药物：邓贤明(厦门大学),盛春泉(海军军医大学),饶熵(清华大学)。 前言 第十七章 生物技术药物：刘涛(北京大学),王永(北京大学),张力勤(北京大学),关景 洋(北京大学)。 第十八章 生物催化与合成生物学：周佳海(南京师范大学),古阳(中国科学院深圳先进技 术研究院),王兰腾(中国科学院深圳先进技术研究院),谌庄琳(中国科学院深圳先进技术研究 院),许雪霞(南京师范大学),高宇翔(中国科学院深圳先进技术研究院),庞翠萍(中国科学院 深圳先进技术研究院),郑少燕(中国科学院深圳先进技术研究院),候雪丽(中国科学院深圳先 进技术研究院),刘佳翼(中国科学院深圳先进技术研究院)。 衷心感谢高松院士、张希院士、周其林院士、郭子建院士、李景虹院士、樊春海院士、周翔 院士、俞飚院士、常俊标院士等多位专家学者在本书编写过程中提出的宝贵意见和建议! 感谢教育部化学“101计划”!感谢参加本书编写的各高校领导和老师的支持! 由于编者的水平和编写时间有限，本书不足之处在所难免，恳请广大读者和同行不吝赐教、 批评指正。编者也将持续修订完善，为读者提供更为适用的《化学生物学》教材。 刘 磊 陈 鹏 2025年3月 目 录 第一章 核 酸 1 1.1 概述 2 1.2 核酸的结构 9 1.3 核酸的生物学功能 18 1.4 核酸的物理和化学性质 29 1.5 核酸分析技术 37 1.6 核酸的合成与修饰 43 1.7 核酸与分子相互作用 56 第二章 蛋白质和多肽 63 2.1 概述 64 2.2 蛋白质和多肽的结构和理化性质 74 2.3 蛋白质和多肽的合成 101 2.4 蛋白质的修饰 137 2.5 蛋白质与分子相互作用 152 参考文献 168 第三章 糖 169 3.1 概述 170 3.2 糖的结构和分类 171 3.3 糖缀合物及其生物功能 175 3.4 糖的合成和修饰 183 3.5 糖的代谢工程 193 3.6 糖与生物分子的相互作用 197 3.7 聚糖与物种进化、生物医学和疾病 202 3.8 聚糖的系统生理学和生物医学应用 211 3.9 糖生物信息学 212 参考文献 213 第四章 脂 质 215 4.1 概述 216 4.2 脂质的结构与分类 217 4.3 脂质的合成与降解 20 4.4 脂质的消化及吸收 230 4.5 蛋白质的脂质修饰 231 Ⅱ I 目录 4.6 脂质的化学合成与化学成像 240 4.7 脂质与生物膜 244 4.8 脂质的相互作用 247 4.9 脂质组学和脂质分析 253 4.10 脂质与信号通路 259 4.11 脂质代谢异常和疾病 262 4.12 脂质的生物医学应用 267 第五章 天然产物 273 5.1 概述 274 5.2 天然产物的发现和鉴定 276 5.3 天然产物的分类及其生源合成途径 283 5.4 天然产物的合成 301 5.5 天然产物的生物功能 308 5.6 天然产物的应用 314 5.7 结语 319 参考文献 319 第六章 生物无机化学 321 6.1 概述 322 6.2 生命体系中金属的成键方式与存在形式 328 6.3 金属蛋白与金属酶的结构与功能 32 6.4 金属与核酸相互作用 350 6.5 无机药物 356 6.6 生物无机化学的其他方面 363 6.7 结语 370 第一章 核 酸 目录 1.1 概述/2 1.1.1 核酸科学研究的起源与历史 进展/2 1.1.2 现代化学和现代生命科学中 的核酸/6 1.2 核酸的结构/9 1.2.1 DNA 与RNA 的结构(含 经典和非经典结构)/9 1.2.2 核小体、染色质和染色体 /14 1.2.3 基因与基因组/16 1.3 核酸的生物学功能/18 1.3.1 DNA 复制/18 1.3.2 RNA的转录与加工/21 1.3.3 RNA 修饰、翻译/24 1.3.4 非编码RNA/26 1.4 核酸的物理和化学性质/29 1.4.1 核酸热变性与分子杂交/29 1.4.2 核酸的化学稳定性及其影响 因素/31 1.4.3 常见的DNA 损伤反应/33 1.4.4 DNA 损伤的检测和修复 机制/35 1.5 核酸分析技术/37 1.5.1 核酸定量分析/37 1.5.2 核酸杂交分析/41 1.6 核酸的合成与修饰/43 1.6.1 寡核苷酸的化学合成与修饰 /43 1.6.2 寡核苷酸的化学修饰技术和 应用/48 1.6.3 寡核苷酸的生物合成与修 饰/50 1.6.4 寡核苷酸的生物修饰和应 用/50 1.6.5 基因合成与克隆/51 1.7 核酸与分子相互作用/56 1.7.1 核酸与小分子的相互作用/57 1.7.2 核酸与蛋白质的相互作用 /59 2 I 第一章 核酸 |1.1 概述 核酸( nucleic acids) 是构成所有已知生命形式的基本分子之一，主要包括脱氧核糖核酸 (DNA) 和核糖核酸( RNA)。它们不仅携带遗传信息，还是细胞功能和生命活动不可或缺的 关键组分。 1.1.1 核酸科学研究的起源与历史进展 核酸研究的历史可以追溯到19世纪，随着分子生物学的兴起和发展，经历了多次重大 科学突破(图1.1)。 约翰 ·弗里德里希 ·米歇尔 (Johann Friednich Miescher) 首次发现核酸 菲比斯 ·莱文 (Phoebus Levene) 定义了DNA的分子 结构——腺嘌呤 (A) 、鸟嘌呤(G)、 胞嘧啶(C) 和胸腺嘧 啶(T) 奥斯瓦尔德 ·艾弗里 (Oswald Avery)、 科林 ·麦克劳德 (Colin MacLeod) 和麦克林 ·麦卡蒂 (Maclyn McCarty) 发现DNA携带遗传 信息 欧文 ·查加夫 (Erwin Chargaff) 定义了碱基配对规 则——腺嘌呤与胸 腺嘧啶配对，胞嘧 啶与鸟嘌呤配对 詹姆斯 ·沃森 (James Watson)、 弗朗西斯 ·克里克 (Francis Crick) 和 罗莎琳 ·富兰克林 (Rosalind Franklin) 发现了DNA 的双螺 旋结构 图1.1 DNA 发现的历史。 在生命科学的探索之旅中，Friedrich Miescher的发现意义非凡，具有划时代的重要 性。1869年，他通过实验揭示了DNA的物质存在，为遗传学和分子生物学的发展奠定了坚 实基础(图1.2)。 Friedrich Miescher 的实验背景：Friedrich Miescher 是瑞士生物学家，专注于生物化 学研究。他对细胞核的化学组成特别感兴趣。19世纪生物学对细胞的研究主要集中在显微 镜下的形态学，而Friedrich Miescher 的研究则是较早将化学分析方法应用于细胞学研究 的尝试。Friedrich Miescher 在实验中使用了淋巴结组织，特别是白细胞，因为这些细胞 含有较大的细胞核，便于提取和分析。通过化学处理和分离技术，他成功从细胞核中提取 出了一种未知物质。这种物质有几个显著特点： (1)高磷酸盐含量：这与细胞质中的其他物质不同，表明它具有独特的化学性质。 (2)主要存在于细胞核中：这一发现提示该物质可能与细胞核功能相关。 根据这些观察结果，Friedrich Miescher 将这种物质命名为“核素”( nuclein ),并进 行了进一步的化学分析，发现它由磷酸、糖和含氮碱基组成。这是对DNA 化学结构的最早 图1.2 Friedrich Miescher的发现。 描述，尽管当时他还没有完全意识到DNA在遗传信息传递中的作用。他的工作揭示了细胞 核内存在一种复杂的化学物质，这一发现启发了后来的科学家去了解遗传物质的本质。 20世纪40年代，Oswald Avery和他的同事在Frederick Griffith肺炎双球菌体内转 化实验的基础上( 图1.3),使用了一种能够使细菌获得新特性的提取物，并试图找出这种 图1.3 肺炎双球菌体内转化实验。 转化现象的分子基础。实验结果表明，这种提取物含有DNA; 使细菌获得新遗传特性的是 DNA,而不是蛋白质或其他分子。这一发现具有革命性意义，因为它首次为DNA为遗传信 息载体的理论提供了确凿证据，从而改变了科学界对遗传物质本质的看法。 紧随Oswald Avery 之后，Erwin Chargaff 通过对不同物种的DNA进行化学分 析，发现DNA中的四种碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)在不同物种中 的比例大致相同。Erwin Chargaff的研究表明了一种特定的碱基配对法则：虽然这四 种碱基的总量在不同物种中可能会有所不同，但腺嘌呤和胸腺嘧啶，以及鸟嘌呤和胞 图1.4 Erwin Chargaff碱基配对法则。 嘧啶的比例通常是相同的(图1.4)。 这一发现为后来的DNA 双螺旋模型 和碱基配对原理的提出奠定了理论 基础。 碱基配对法则是理解DNA 如何 精确复制自身的关键。在细胞分裂过 程中，DNA分子通过碱基配对机制进 行复制，确保遗传信息的精确传递。 碱基配对为保存遗传信息提供了一种 稳定可靠的方式，使这些信息能够在 细胞分裂过程中准确地复制并在生物 体内传递。 1.DNA 双螺旋模型 James Watson和Francis Crick 于1953年提出的DNA双螺旋模型是分子生物学发展史上 的一个重要里程碑。这一模型不仅揭示了DNA的精细结构，也为理解其功能和遗传信息传 递机制提供了重要依据。 James Watson和Francis Crick的发现建立在Rosalind Franklin 及其同事Maurice Wilkins的 X射线衍射研究基础之上。Rosalind Franklin的 X射线照片提供了DNA分子结构的关键线索，显示 出了一种规则的重复模式，表明DNA分子可能具有一种规则的 对称结构。James Watson和Francis Crick根据X 射线衍射数据， 结合已知的化学和生物学信息，提出DNA分子是由两条长链构 成的双螺旋结构(图1.5)。这两条长链以碱基对的方式相互配 对，形成了稳定的DNA结构。在双螺旋模型中，James Watson 和Francis Crick提出了腺嘌呤( A) 与胸腺嘧啶( T), 以及鸟嘌 呤( G) 与胞嘧啶( C) 之间的互补配对原理。这种配对确保了 遗传信息的准确复制。 DNA双螺旋模型彻底改变了人们对遗传信息如何传递的认 识。它揭示了DNA在细胞分裂时如何准确地自我复制，以及遗 传信息如何在生物体内传递。这一模型的提出开启了分子生物 学的新纪元，为后续的DNA复制、修复、重组及蛋白质合成等 1.1 概述 领域的研究奠定了基础。它不仅阐明了DNA的结构细节，而且为理解遗传信息的存储、复 制和表达这一生命中最基本的分子过程提供了重要的理论基础。 克隆技术是一种与DNA 复制相关的生物技术，通过这种技术可以在无性繁殖条件下产 生与原生物基因相同的个体。克隆技术的核心原理是DNA 复制和细胞再生能力。在动物克 隆中，最常用的方法是体细胞核移植技术(somatic cell nuclear transfer,SCNT),即把 体细胞核移植到去核的卵细胞中，通过电刺激或化学物质激活，使其发育成一个完整的个 体(图1.6)。在这一过程中，新个体细胞核的遗传信息完全来自供体细胞的DNA, 因此在 基因上与供体细胞完全相同。 图1.6 克隆技术。 克隆技术使得科学家可以精确地复制特定的基因或DNA 片段，为研究基因功能和治疗 遗传疾病提供了可能。通过克隆技术，可以制备出基因一致的细胞、组织或器官，为器官 移植和再生医学开辟了新的路径。克隆技术还可用于培育高产、抗病、抗逆的作物和动物 品种，提高农业生产效率和食品安全性。克隆濒危动物有助于保护和恢复生物多样性。 2. RNA的发现历史 RNA( 核糖核酸)的发现和研究对于理解生物体内的遗传信息的流动和蛋白质合成的机 制至关重要。RNA的发现史是一个探索和发现的历程，深刻影响了人们对生命科学的理解。 RNA最初被认为是一种独特的核酸，Friedrich Miescher在1869年发现DNA时也观察到了这 种独特的酸性物质。然而，在最初的几十年里，由于当时的研究重点是DNA,RNA 的独特 性质和功能并未被充分认识。 19世纪90年代，Albrecht Kossel在研究酵母核酸时进一步研究了RNA与DNA的差异。 通过化学分析，他确定RNA包含核糖(一种糖),这是它与DNA( 含脱氧核糖)的不同之 处。20世纪初，随着生物化学技术的发展，科学家们开始探索RNA的化学结构。研究人员 发现，RNA是由核糖核苷酸串联而成的链状分子，其中每个核糖核苷酸包括核糖、磷酸和四 种不同的含氮碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。随着人们对RNA化学结构的进一 步了解，科学家们开始认识到RNA在细胞功能中的作用。虽然早期对RNA功能的理解相对 有限，但这一时期的研究为后来发现RNA在遗传信息传递、蛋白质合成和其他过程中的关 键作用奠定了基础。 RNA 世界”假说 “RNA世界”假说是20世纪80年代提出的一个革命性概念，对理解生命的起源和早 期进化产生了深远影响(图1.7)。 (a) RNA 世界 (b)RNP 世界 (c)DNA/RNA/蛋白质世界 图1.7“RNA 世界”及其到当今“DNA/RNA蛋白质世界”的过渡。 20世纪80年代以前，对生命起源的研究主要集中在DNA和蛋白质上。然而，随着 人们对RNA分子功能的深入了解，科学家们开始思考RNA 在生命早期阶段可能扮演的角 色。Carl Woese和 Walter Gilbert等科学家最早提出了“RNA世界”假说。根据RNA 既 能储存信息又能催化化学反应的独特性质，他们认为RNA 可能是生命早期阶段唯一的遗 传物质。 RNA分子能够储存遗传信息(类似于DNA),还能作为核酶(一类RNA分子)催化重要 的生化反应(类似于蛋白质的酶)。某些RNA分子能够催化包括自身复制在内的反应，这 支持了RNA 可以在没有蛋白质或 DNA的情况下支撑早期生命形式的观点。在实验室中合成 的RNA分子被证明可以执行多种催化功能，这些发现支持了RNA分子可能在早期生命中发 挥核心作用的观点。在某些最原始的生命形式中，例如某些病毒和原核生物，RNA仍然发 挥着关键的遗传和催化作用，这与“RNA世界”假说的预测是一致的。 1.1.2 现代化学和现代生命科学中的核酸 核酸作为遗传信息的主要载体，对现代化学和生命科学产生了深远的影响。核酸在基因 组学、疾病诊断和治疗等领域发挥着至关重要的作用。 1.核酸在基因组学中的应用 DNA测序技术的发展是分子生物学和遗传学领域的一个重要里程碑。Frederick Sanger 于 1977年开发的测序技术为后来的基因组学研究和应用奠定了基础(图1.8)。该方法以双脱 氧核苷三磷酸( ddNTPs) 引起的DNA聚合反应终止为核心原理，当这些核苷酸掺入DNA链 时 ，DNA 链就会终止延长。桑格( Sanger) 测序涉及创建多条部分合成的DNA链，每条链在 不同位置终止。这些链可以通过电泳分离，并根据其长度确定原始DNA模板的核苷酸顺序。 1.1 概述 (2)通过毛细管凝胶电泳对不同 长度的片段进行分离 图1.8 桑格测序。 随着技术的发展，DNA测序变得更加自动化和高效。21世纪初，下一代测序技术( next- generation sequencing, NGS) 应运而生(图1.9)。这种技术能够对数百万甚至数十亿DNA片 段进行并行测序，显著降低了成本，加快了测序速度。 (1) (4) (2) (5) (3) 正向链和反向链的克隆 拷贝在一个簇中形成 (6) 图1.9 下一代测序技术。 DNA测序技术是人类基因组计划取得成功的关键。2001年，人类基因组草图的成功绘 制为首次全面了解人类基因蓝图铺平了道路。DNA测序技术在古DNA研究、疾病诊断、个 体化医疗、微生物组学和许多其他领域中发挥着重要作用。它使科学家能够了解遗传疾病的 基因基础，开发新的治疗方法，并更深入地了解生物多样性。DNA测序技术的普及也带来了 伦理和隐私方面的挑战，特别是在个人基因组信息的处理和使用方面。 2.祖先追溯和古DNA研究 通过分析从现代人和古代人类遗骸中提取的DNA, 科学家们能够追溯人类迁徙的路径， 理解不同人群之间的遗传联系。例如，通过分析Y 染色体和线粒体DNA, 研究人员可以揭 示个体的直系祖先来源，绘制人类迁徙地图，甚至帮助人们发现自己未知的族谱信息。对尼 古DNA 化学修饰 片段化 污染 线粒体DNA 16500碱基对 图1.10 古人类DNA研究。 母亲 孩子 父亲1 父亲2 安德特人基因组的测序显示，他们与现代人之 间存在基因交流，在非洲以外的现代人群中， 有1%~2%的DNA源自尼安德特人。这一发现 重塑了人们对早期人类种群间交互的认识，表 明不同人类群体之间的迁移和混合比之前想象 的更为复杂(图1.10)。Svante Pääbo因为在这 一领域的杰出贡献，被授予了2022年诺贝尔生 理学或医学奖。 3. 亲子鉴定和家族遗传病筛查 亲子鉴定中核酸技术的使用为确定亲子关 系提供了一种准确的方法。通过比较孩子、母 亲和假定父亲的DNA序列，可以明确确认亲子 关系(图1.11)。此外，法医学中的DNA指纹 技术利用个体之间的基因差异来识别犯罪现场 遗留的生物样本(如血液、头发或皮肤细胞), 为犯罪侦破提供重要线索。 家族遗传病筛查是利用高通量测序技术和 分子遗传学方法评估家族成员遗传病风险的一 项重要程序。通过分析个体的基因组，科学家 能够识别那些可能导致遗传性疾病的变异基因， 从而在早期阶段对疾病进行预防、管理和干预。 这一技术在遗传咨询、早期诊断、个性化治疗 及疾病风险评估中发挥着重要作用。家族遗传 病筛查为有家族遗传病史的个人提供遗传咨询 的科学依据。通过分析家族成员的遗传信息， 遗传咨询师能够为客户提供关于遗传风险、疾 病预防策略和生育的专业意见。 4. 全基因组测序与个性化医疗 全基因组测序( whole-genome sequencing, WGS) 作为下一代测序技术的一项重要应用 (图1.12),是现代医学和生命科学的一个重要 发展方向，通过对覆盖整个基因组的所有DNA 序列进行测序，准确检测出个体基因组中的变 异集合，为个性化医疗和精准医学提供了强有 力的工具。通过分析个人基因组，可以识别特 定的遗传变异，预测个体对某些疾病的易感性。 基因组数据有助于预测个人对特定药物的反应， 从而指导更适当的药物选择和剂量调整。基于 个体的遗传背景，医生可以为患者定制更精准 1.2 核酸的结构 I 9 的治疗计划，从而提高治疗效果并减少不良反应。 全基因组测序为早期诊断、个性化治疗和疾病预防提供了新的可能性，尤其在癌症、 罕见病和遗传性疾病的治疗中展现出巨大潜力。个体基因组测序和精准医学正在开启医疗 保健的新时代。通过利用个体的遗传信息，医学专家可以为每个人提供更精准、更有效的 医疗服务。然而，这一领域的发展也伴随着技术、伦理和社会挑战，这些挑战需要跨学科 的合作和不断的科技创新来克服。 5. 核酸在疾病诊断和治疗中的应用 核酸技术的发展极大地改变了医学领域，尤其是在疾病的诊断和治疗方面。利用核 酸技术，科学家们可以更早地诊断疾病，并为患者提供更加精准的治疗方案。分子诊断 是一种利用分子生物学技术进行疾病诊断的方法，特别是通过检测和分析DNA或 RNA 来识别疾病相关的遗传变异或病原体。在早期检测方面，分子诊断技术展现出其独特 优势。 聚合酶链式反应( polymerase chain reaction,PCR)是一种体外DNA扩增生物技术，可 快速且大量地制备特定DNA序列的复制产物。它通过循环的加热和冷却过程，在酶的作用 下复制目标DNA片段，使之数量大量增加。PCR技术具有极高的灵敏度，能够从极少量的 样本中检测到特定的DNA序列，甚至是单一的病原体或细胞。 PCR技术在诊断艾滋病病毒、乙型肝炎病毒和结核分枝 杆菌等传染病方面发挥着关键作用。即使在症状出现之前或病 原体含量较低时，它也能检测出病原体的遗传物质。对于囊 性纤维化、镰状细胞性贫血和遗传性癌症等特定遗传性疾病， PCR技术能够识别致病基因的突变。 分子诊断技术，特别是PCR及其衍生技术，已成为现代 医学中不可或缺的工具(图1.13)。它们在早期检测传染病和 遗传性疾病方面展现出了巨大的潜力和价值。随着技术的进 步，分子诊断技术未来将在更广泛的临床应用中发挥作用，尤 其是在个体化医疗和精准医疗领域。 图1.13 基于PCR及其衍生技术的分子诊断。 |1.2 核酸的结构 1.2.1 DNA 与 RNA 的结构(含经典和非经典结构) 1. 核酸的化学组成 核酸是由核苷酸单元按特定顺序连接而成的多聚物。核苷酸由碱基、戊糖和磷酸组 成。根据戊糖的种类，核酸可分为脱氧核糖核酸( DNA) 和核糖核酸( RNA) 两种。其 中，基因组的DNA 承担了遗传信息的存储、复制与传递的关键角色。不同生物的基因组 大小各异，反映了它们遗传信息的复杂性和多样性。基因组大小通常以碱基对( bp) 的 数量来表示，从简单的病毒到复杂的多细胞生物，基因组大小可以从几千个碱基对到数 10 I 第一章 核酸 十亿个碱基对不等。以人类为例，其基因组的大小约30亿碱基对。RNA在基因调控与 蛋白质合成过程中起着重要作用，其中参与蛋白质合成的有三类：信使RNA(messenger RNA, mRNA)、转运RNA(transfer RNA,tRNA) 和核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA)。 mRNA所占比例较低，为1%~5%,负责编码蛋白，将储存在DNA中控制蛋白质合成 的遗传信息传递给核糖体，并通过其碱基顺序决定蛋白质的氨基酸序列，完成遗传信息 的传递。tRNA占 RNA 总量的10%~20%,起着携带和转移活化氨基酸的作用，可根据 mRNA的遗传密码通过核糖体将氨基酸连接起来，形成多肽链。rRNA占总RNA的比例高 达70%~80%,是组成核糖体的主要成分。除了上述三种主要的RNA类型外 ，细胞内还存 在着大量的非编码RNA, 包括微小RNA(miRNA) 、长链非编码RNA(IncRNA )、核内小 RNA( snRNA)、核仁小RNA(snoRNA) 和环状RNA(circRNA) 等。这些非编码RNA不 编码蛋白质，但在基因表达调控、基因沉默、染色体结构维持和细胞分化等过程中发挥着 重要作用。 2. 核酸的一级结构 核苷酸通过3',5'-磷酸二酯键聚合形成核酸。核酸链具有方向性，含5'-磷酸基和3'- 羟基两个末端，每个核苷酸单元通过其3'端的羟基与邻近核苷酸5'端的磷酸基相连，形成 3',5′-磷酸二酯键(图1.14)。 (1) DNA的空间结构 在DNA双螺旋结构中，两条DNA互补链反向平行，一条链的方向为3'-5',另一条链的 方向为5'-3'。在这一结构中，亲水的磷酸-脱氧核糖骨架位于外侧，而疏水的碱基面向内侧， RNA的碱基 C G A RNA DNA 图1.14 核酸的结构。 1.2 核酸的结构 I 11 与螺旋轴呈垂直排列。大沟( major groove)与小沟( minor groove)的结构特征有利于转录因 子等蛋白质分子的识别和结合。DNA链间的稳定性由碱基间的氢键和碱基堆积力共同维持， 其中A与T 间形成两个氢键，G 与C 间形成三个氢键。 在生物体内，DNA主要以B型右手双螺旋结构存在，其特点是每10个碱基对构成一圈 螺旋，螺旋的直径大概为2nm, 每对相邻碱基之间的距离保持在0.34 nm。除了经典的B型 右手螺旋结构，DNA双螺旋结构还存在一些非经典构型，如A型 、C 型 、D 型、E 型，以及 Z型左手双螺旋DNA分子。这些构象的形成取决于离子条件、核酸序列，以及某些特殊的结 合蛋白。此外，H-DNA是一种特殊结构的三股DNA,通常存在于基因的调控区域，可抑制 基因的转录过程。 此外，某些富含鸟嘌呤重复序列的DNA可以在阳离子稳定作用下形成四链螺旋结构， 称为G- 四链体( G-quadruplex)。四个鸟嘌呤碱基以Hoogsteen氢键作用形成环状平面结构 (G -quartet,G- 四分体),并进一步通过π-π堆叠形成三维G- 四链体结构(图1.15),这 种结构在热力学和动力学上都很稳定。G- 四链体的稳定性取决于口袋内所结合的阳离子 M+的种类，已知钾离子的稳定效果最佳。由于G-四链体的分子特性及螺旋取向不同，可 以形成各种形式的G- 四链体。G- 四链体多存在于一些在功能上及进化上都相当保守的基 因组区域，可能是作为分子识别的元件之一，在细胞中发挥一些特殊的生物学作用，如 端粒的保护和延长，转录调节，还可能与染色体的排列重组和与DNA复制相关的疾病有 一定的关系，是药物设计的新靶点。 (a) 平行 (b) 图1.15 四个G 碱基形成G- 四链体。 反平行 (2) DNA上的化学修饰 DNA 上的天然化学修饰是表观遗传调控的重要组成部分，在调节基因表达、促进细胞分 化和维持基因组稳定等生物学过程中发挥关键作用。对DNA化学修饰的研究可以追溯到20 世纪40年代。1948年，Hotchkiss首次发现了甲基化胞嘧啶，标志着DNA化学修饰研究的 开始。随后，科学家们陆续发现了DNA上的其他天然化学修饰，如羟甲基化(5hmC)、醛基 化(5fC) 和羧基化(5caC) 等。这些发现为理解基因表达的复杂性提供了新的视角，揭示 了遗传信息之外的另一层调控机制。 DNA甲基化主要指胞嘧啶碱基的第5位碳原子( C5) 上添加甲基的过程。在哺乳动 5caC 5fC 图1.16 胞嘧啶甲基化与去甲基化过程。 物中，甲基化由甲基转移酶( DNA methyltransferase, DNMT)1/3A/3B催化，主要发生在CpG双核苷酸序列 上，是基因沉默的重要机制之一。甲基化的胞嘧啶与 鸟嘌呤形成的CpG对可抑制转录因子的结合，从而调 控基因的表达。羟甲基化是甲基化胞嘧啶的进一步修 饰，由TET(ten-eleven-translocation) 酶催化实现(图 1.16)。羟甲基化在动态调控DNA甲基化状态、促进基 因表达，以及参与脑发育等过程中发挥作用。DNA醛 基化和羧基化两种修饰较为罕见，主要出现在DNA损 伤和修复过程中。醛基化修饰可以被特定的DNA修复 酶识别和处理，而羧基化修饰则可能参与调节DNA损 伤的应答。 5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5 mC) 含有一个 非极性甲基，在细胞转录调控中，修饰不仅会直接影响 转录因子的结合，还涉及更广泛的表观遗传机制。5mC 可通过招募一类称为读码蛋白( reader proteins)的特 定蛋白质来影响转录。这些蛋白质能够识别甲基化的 DNA, 并调节该区域的基因表达。常见的读码蛋白包括甲基化CpG结合蛋白(methyl-CpG binding protein,MBD家族蛋白),例如methyl-CpG-binding protein 2(MeCP2 ), 它们通过与 其他表观遗传修饰因子，例如组蛋白去乙酰化酶复合体协同作用，进一步改变染色质结构， 导致转录抑制。5 mC的去甲基化可以随细胞分裂而被动去除或在TET酶、胸腺嘧啶DNA糖 基化酶( TDG) 与碱基切除修复( BER) 机制的共同作用下完成主动去除。 此外，5mC还与组蛋白修饰之间存在串扰( crosstalk) 交互作用。例如，DNA甲基化常 见于异染色质区域，这些区域富含组蛋白H3的第9位赖氨酸三甲基化( H3K9me3)修饰， 该修饰是一种转录抑制标志。5 mC的存在可以稳定这种组蛋白修饰，反之，组蛋白的甲基化 修饰也能促进DNA甲基转移酶的作用，增强DNA甲基化。这种动态的互作不仅调节基因表 达，也是细胞在不同发育阶段或在应对环境压力时调控基因表达的重要机制。通过这样的机 制 ，5 mC对细胞功能和命运具有重要的影响。 N⁶-甲基腺嘌呤(6mA) 是另一种重要的DNA甲基化修饰，主要存在于原核生物中。 这种修饰通过特定的DNA甲基转移酶，如DNA腺嘌呤甲基化酶( DNA adenine methylase, Dam) 在腺嘌呤碱基的第6位氮原子上添加甲基基团实现。在原核生物中，6mA的分布和功 能具有多方面的生物学意义。6mA在调控基因表达、DNA复制和修复、宿主防御机制及维持 基因组的表观遗传稳定性中扮演关键角色。例如，它通过影响基因的启动子区域甲基化模式 来调节基因表达，或通过标记新合成DNA来帮助修复系统识别并修复复制错误。此外，6mA 还参与限制-修饰系统，保护细菌免受外来DNA,如噬菌体的侵害。在霍乱弧菌等一些病原 体中，6mA还参与毒力基因的调控，影响病原体与宿主的相互作用。这些机制不仅影响了细 菌的生存和适应性，还在其长期进化过程中起到了重要作用，为研究原核生物基因表达调控 和开发新的抗生素提供了基础。 DNA上的天然化学修饰极大地丰富了遗传信息的表达和调控。这些修饰不仅在基因沉 1.2 核酸的结构 I 13 默、细胞分化、发育调控等生物过程中发挥关键作用，而且在肿瘤发生和遗传疾病等病理状 态下的变化也为疾病诊断和治疗提供了新的策略。随着分子生物学和遗传学技术的不断进 步，深入了解这些化学修饰将为揭开生命科学的神秘面纱提供重要线索。 (3) RNA的空间结构 RNA的分子结构与DNA有明显不同，RNA通常呈现单链线性结构，但在特定区域通过自 我折叠和碱基配对形成局部的双链结构。在这些区域内，A 与U 配对，G 与C 配对，偶尔也会 出现非典型的配对，如G 与U 配对。基于分子内碱基配对，RNA能够形成多样的二级结构 (图1.17)。在非配对的RNA 区域，会形成如凸起( bulge)、环形( loop)、发夹( hairpin) 等 结构。只有当这些RNA分子进一步折叠形成三级结构时，它们才能发挥相应的生物功能。 双链片段 (dsRNA) 双茎连接 (同轴堆叠) 凸出区 假结 —(j) j≥1 内环(如果i=j, 为对称内环； 如果i ≠j, 为不对称内环) 接吻发卡结构 图1.17 不同RNA 二级结构。 ①tRNA的结构。tRNA通过转运氨基酸和识别密码子，在蛋白质合成中发挥着重要作 用。每种氨基酸都对应一种或多种特定的tRNA, 因此细胞中tRNA的类型众多。在tRNA的 二级结构中，碱基配对形成的局部双螺旋构成了其臂部，而未配对的碱基则形成环状结构， 由此呈现出一个三叶草型的二级结构(图1.18)。在三叶草型结构的基础上，未配对碱基的 空间折叠形成了倒L 型三级结构。 图1.18 tRNA二级结构。 14 I 第一章 核酸 ②mRNA的结构。原核生物的mRNA结构比真核生物更直接、更简单。在原核生物中， mRNA的转录与翻译几乎同步在同一细胞区域内展开，转录后无须修饰就能直接翻译成蛋白 质。原核生物mRNA 编码区域之间可能含有影响核糖体结合的间隔序列，并在5'端与3'端 具有调控翻译启动和终止的非编码区。在真核细胞中，遗传信息通过DNA模板转录生成包 含内含子和外显子的前体mRNA(pre-mRNA), 这种初始转录本( primary transcript)大小不 一 ，也被称为核不均一 RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnRNA )。hnRNA在细胞核内短暂 存在，经过剪接( splicing) 及5'端和3'端修饰等加工过程后成为成熟mRNA, 然后被转运 出细胞核，经过多级调控最终翻译为有功能的蛋白质。因此，真核细胞mRNA的合成与其表 达活动是分别在不同的空间和时间内实现的。真核生物一个mRNA分子只包含一条多肽链的 信息，即mRNA为单顺反子结构。 ③rRNA的结构。rRNA分子以单链形式存在，具有较大的分子质量和复杂的结构。目 前，人们对其一级结构有较深入的了解，但其高级结构和生物功能还有待进一步探索。原核 生物主要的rRNA有3种，即小亚基16S rRNA和大亚基5S、23SrRNA。真核生物则有4种， 即5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA和28S rRNA。原核生物和真核生物的核糖体均由大、小 两种亚基组成。rRNA分子作为骨架与多种核糖体蛋白装配成核糖体后才能发挥相应功能。 核酸(包括DNA和RNA) 是细胞的基本组成成分，在遗传信息的存储、传递和表达调 控中各自发挥着独特而重要的角色。DNA作为遗传信息的载体，通过复杂的结构和调控网络 确保基因的正确存储；而RNA则作为信息的传递者和调控者，在转录和翻译的过程中，影 响着蛋白质的合成和细胞功能。这两者相互配合，共同维持着生物体的生命活动及其遗传特 性。在细胞核内，DNA组装并压缩成核小体、染色质和染色体等高级结构。了解这些结构对 于理解遗传物质的组织和功能至关重要。 1.2.2 核小体、染色质和染色体 1. 核小体的组成和功能 核小体是染色质的基本单位，由DNA和组蛋白构成。核小体的核心结构是由8个组蛋 白分子(通常为H2A 、H2B 、H3和H4各两个)组成的八聚体。约146个碱基对的DNA在 这个八聚体周围缠绕约1.75圈，形成一个核小体核心单元(图1.19)。有了核小体的组织结 构 ，DNA能够以高度紧凑的形式“压缩”存储在细胞核内。这种结构不仅能保护DNA免受 损伤，还能让细胞有效管理其庞大的基因组。 图1.19 核小体结构。 核小体结构的调节对于基因表达至关重要。组蛋白的化学修饰(如乙酰化 和甲基化)可改变核小体的稳定性，并影响DNA的可及性。这种动态调节机 制使得细胞可以精确控制基因的活性，以应对内外环境的变化。核小体的结构 决定了转录因子和其他调控蛋白能否进入DNA的特定区域。当核小体紧紧包 裹DNA时，基因通常会被沉默。相反，当核小体结构松弛时，基因更有可能被 转录。 细胞可以通过重塑核小体结构来调节基因的表达，这涉及核小体的滑动、 组蛋白的交换，以及组蛋白修饰的添加或移除。核小体也参与表观遗传调控， 即在不改变DNA序列本身的情况下改变遗传物质的表达。组蛋白的修饰模式可 1.2 核酸的结构 I 15 以在细胞分裂时传递，从而影响后代细胞的基因表达。 在DNA复制和修复过程中，核小体必须被部分解构，以便复制酶和修复酶访问DNA。 这一过程需要精确的调控，以保证DNA的完整性和稳定性。在细胞分裂过程中，特别是在 有丝分裂阶段，核小体的结构会发生巨大变化，这样DNA才能有效地分布到子细胞中。 2. 染色质的组织结构 染色质在细胞核中扮演着核心角色，是遗传信息传递和 基因表达调控的关键结构。深入了解染色质结构有助于揭示基 因是如何在细胞内组织和调控的。染色质是DNA和蛋白质的 复合体。在染色质中，核小体通过将DNA缠绕在组蛋白上来 “压缩”DNA的长度，增加其密度(图1.20)。这种结构不仅保 护DNA免受损伤，还通过控制特定基因区域的可及性来调节 基因的表达。在细胞分裂期间，染色质会凝聚成染色体，确保 遗传信息能够准确分配给子细胞。在非分裂过程中，染色质的 结构也会发生变化，以调节基因活动并对来自细胞内外的信号 作出响应。 染色质可分为松散的常染色质和紧凑的异染色质。常染色 质区域的基因通常处于活跃状态，易于被转录机器访问；而异 图1.20 染色质与染色体结构。 染色质区域则相对沉默，基因表达较少。这种分类在基因表达 调控中发挥重要作用。细胞通过将染色质区域从常染色质改变为异染色质的状态来控制特定 基因的表达。 染色质的结构对于基因的表达至关重要。它不仅决定了基因是否可以被转录因子和RNA 聚合酶访问，也影响了基因的转录效率。染色质确保了在细胞分裂过程中遗传信息的稳定传 递。它的结构变化对于正确的染色体分离和避免基因重排至关重要。染色质的结构变化能够 导致基因的沉默或激活，这对于细胞分化和发育至关重要。染色质的重塑是一个动态过程， 涉及组蛋白的置换、滑动或移除，染色质组分的共价修饰( DNA的甲基化修饰，组蛋白修 饰),以及染色质重塑因子( chromatin remodeling complexes, CRCs) 的非共价修饰。这些变 化使得细胞能够快速调整其基因表达模式，从而在调节细胞生理功能和维持细胞平衡方面发 挥重要作用。此外，染色质结构的可塑性使得细胞能够对环境变化作出迅速反应，从而保持 生理功能和适应能力。 3. 染色体的组成、类型和功能 染色体作为细胞遗传信息的载体，在细胞生物学和遗传学中具有重要意义。它们不仅包 含着生命的遗传蓝图，而且在DNA的复制、分配和基因表达中扮演核心角色。 在细胞分裂(如有丝分裂)过程中，染色质会进一步凝聚和压缩，形成更加紧密和清 晰可辨的结构——染色体。每条染色体包含了一条连续的DNA分子及其相关的蛋白质。染 色体中的DNA以高度有序的方式包装，形成从核小体到更高阶的染色质结构。这种包装不 仅使得长的DNA链能够适应细胞核的有限空间，还能保护DNA免受损害。除组蛋白外，与 DNA相互作用的蛋白质还包括维持染色体结构的蛋白质和调节基因表达的蛋白质。 人类有23对染色体，其中22对常染色体在所有体细胞中都是相同的，决定了大多数遗 传特征。第23对是性染色体，男性为XY, 女性为XX。性染色体除了决定性别外，还携带 16 I 第一章 核酸 一些与性别无关的遗传信息。这些染色体在遗传疾病和性别特征的研究中具有重要意义。不 同物种的染色体数量和结构各不相同，而在同一物种中，染色体异常(如数量或结构的变 化)通常与遗传疾病有关。染色体的主要功能是在细胞分裂期间确保遗传信息被准确复制和 均等分配给子细胞。这一过程对于生物体的生长、发育和繁殖至关重要。 染色体不仅是DNA的存储结构，也是基因组织和表达的重要平台。基因在染色体上的 位置影响其表达模式和调控方式。染色体的完整性对于维持细胞功能和遗传稳定性至关重 要。DNA损伤修复和染色体重组是保持染色体完整性的关键过程。 核小体、染色质和染色体是核酸在细胞中组织的不同层面。它们不仅提供了细胞内遗传 物质的物理架构，还参与了复杂的遗传调控过程。了解这些结构的组成和功能是理解细胞遗 传学和分子生物学的基础。随着研究的深入，对这些结构的了解将不断加深，从而揭示细胞 功能和生命过程的更多秘密。 1.2.3 基因与基因组 基因是遗传学的核心概念之一，了解基因的定义、结构和功能对于揭示生物的遗传特征 和功能至关重要。基因是DNA序列中的一段，负责储存遗传信息；作为遗传特征的基本单 位，每个基因对应特定的表型特征或生物体功能，基因编码特定的蛋白质或RNA( 图1.21) 直接或间接影响生物体的结构、功能和行为。基因在生物体的发育、生理过程和遗传特征的 形成中具有决定性作用。从单个细胞的功能到整个生物体的复杂特征，基因都会对其产生 影响。 在真核生物中，基因的结构复杂而精细，通常由编码区(外显子)和非编码区(内含 子、调控序列)组成。外显子包含了合成蛋白质所需的遗传信息，是蛋白质生产的蓝图。内 图1.21 基因结构。 1.2 核酸的结构 I 17 含子则是在RNA加工过程中需被剔除的非编码区域，这些内含子虽然被去除，但研究表明 它们可能在基因表达的调控、RNA剪接的选择性及基因组的稳定性等方面发挥重要作用。基 因的这种构造特性使得通过RNA的不同切割与重新组合方式，可以产生多种蛋白质的变异 形式，即剪接变异。除内含子之外的非编码区还包括多种调控序列，如启动子、增强子、终 止子和静默子等。启动子位于基因的转录起始点，是RNA 聚合酶结合和启动转录的关键序 列。增强子则可以在距离很远的地方调控基因的转录活性，通过促进转录因子与RNA聚合 酶的结合来增强基因表达的效率。终止子则负责信号的传递，标志着转录过程的结束，以 确保合成的RNA分子具有合适的长度和结构。静默子能够通过抑制转录因子结合或改变 DNA的构象，降低特定基因的表达。此外，长链非编码RNA(IncRNA) 和具有生物活 性的小RNA ( 如miRNA和siRNA等)也在基因调控中发挥重要的作用。IncRNA通过与 DNA、RNA或蛋白质的相互作用，影响基因转录、RNA剪接和翻译等多个层面的调控。小 RNA则以特定的方式结合到靶mRNA上，从而影响其稳定性和翻译效率，参与基因表达的 后转录调控。 基因通过指导mRNA合成及蛋白质翻译，控制生物体的各种生理功能。生物体内的基因 表达调控是一个非常复杂的过程，包括转录后的RNA 修饰、RNA的剪接、蛋白质翻译的调 控及蛋白质的后修饰等多个阶段。基因表达的失调或基因突变可能导致各种遗传性疾病或其 他健康问题，因此，深入了解基因的功能和调控机制对疾病的预防、诊断和治疗具有至关重 要的意义。 1. 基因组的概念 基因组是现代遗传学和分子生物学的一个核心概念，涉及生物体内所有遗传信息的研 究，包括DNA序列的组织、功能及其在生物进化中的变化。基因组是生物体内所有遗传信 息的完整集合，不仅包括DNA中的所有基因，还包括基因间的非编码序列。它是生物体遗 传特征和生命活动的基础。基因组包含多种类型的DNA序列，如编码区(基因)、非编码区 (如内含子、调控序列)、重复序列及转座元件等。基因组相当于生物体的遗传蓝图，它指导 着个体的发育、生理功能和行为。基因组中的信息通过转录和翻译过程转化为生物体的结构 和功能。 不同物种的基因组大小差异很大，例如，细菌的基因组可能只有几百万个碱基对，而人 类基因组约有30亿个碱基对。基因组不仅包括编码蛋白质的基因，还包括大量非编码RNA 基因、调控序列(如启动子、增强子)、重复序列和转座元件等。大部分高等生物的基因组 中，非编码DNA占据了绝大多数。这些非编码区域在基因调控、基因组稳定性和染色体结 构中扮演重要角色。基因突变是基因组变异的主要形式之一，包括点突变、插入、缺失等。 这些变异可以影响基因的功能，从而影响生物体的表型。染色体的结构变化，如染色体重 排、复制和融合等，也是基因组变异的重要来源。这些变化在物种进化和某些疾病(如癌 症)中起着关键作用。基因组复制，包括基因的复制和基因组的多倍体化，是生物适应和进 化的另一个重要机制。这些复制事件增加了基因组的复杂性和多样性。 随着测序技术的发展和成本降低，全基因组测序日益普及，为个体化医疗和精准医学提 供了数据基础(图1.22)。未来的基因组学研究将更加注重遗传性疾病的治疗，特别是通过 基因疗法和基因编辑技术来纠正遗传缺陷。基因组学与计算生物学、生态学和人类学等其他 学科的结合将进一步扩大其研究范围和应用领域。 18 I 第一章 核酸 图1.22 全基因组测序。 2.线粒体DNA 线粒体是细胞中负责能量转换的重要细胞器，被誉为“细胞的能量工厂”。它们拥有自己 的遗传物质——线粒体DNA(mtDNA), 这赋予了线粒体独特的遗传特性和功能(图1.23)。 线粒体DNA是闭合的双螺旋环形DNA, 人类线粒体DNA大约包含16569个碱 细胞 基对，编码37个基因，包括13个呼吸链蛋白编码基因、22个tRNA基因和2 个rRNA基因。线粒体DNA主要通过母系遗传，这一特性使得线粒体DNA成 为研究人类母系遗传、群体迁徙和进化的重要工具。 线粒体DNA通过转录过程产生mtRNA,包 括messenger RNA(mRNA)、 ribosomal RNA(rRNA)和transfer RNA(tRNA)。这些RNA分子对于线粒体内 蛋白质的合成至关重要。mtRNA在线粒体内的蛋白质生物合成中发挥核心作 用，特别是那些参与细胞呼吸链和能量产生的蛋白质。此外，mtRNA的修饰和 加工也是调控线粒体功能的重要环节。 由于线粒体DNA的突变或缺陷可能导致线粒体功能障碍，进而影响细胞 能量供应，故许多遗传性疾病与线粒体DNA的突变有关。这些疾病通常影响具 有高能量需求的器官，如心脏、肌肉和大脑。 |1.3 核酸的生物学功能 1.3.1 DNA 复制 DNA复制是所有生物体维持其遗传连续性的基本过程。它涉及一系列精确且复杂的步 骤，确保遗传信息在每次细胞分裂时都被准确复制和传递。了解DNA复制的基本概念对于 理解生命的分子基础至关重要。 1.3 核酸的生物学功能 1 19 1.DNA 复制的基本概念 DNA复制是生命过程中最基本的环节之一。它确保遗传信息能够从一代细胞传递到下一 代细胞，从而维持生物体的遗传特性。每个新生成的细胞都需要一套完整的DNA来执行其 生物学功能。DNA复制不仅在维持遗传稳定性方面发挥作用，同时也是遗传变异的源头，为 生物进化提供原材料。 半保留复制模型是DNA复制的核心概念，它认为在复制过程中，每个新的DNA分子由 一个旧链(模板链)和一个新合成的链组成。这种复制方式确保了遗传信息的准确传递和一致 性。原始链作为模板，指导新链的合成，从而减少复制错误的可能性。半保留复制模型还意味 着DNA的双螺旋结构在每次复制后都被保留下来，保证了遗传信息的稳定性(图1.24)。 DNA复制三种可能的方式 半 保 留 复 制 全 保 留 复 制 散 布 复 制 新合成的链 原始模板链 *未发现具有生物学意义 图1.24 DNA半保留复制与其他复制模型。 DNA复制总是沿5'-3'方向进行。这是因为DNA聚合酶只能在新链的3'端添加核苷酸。 在复制叉两侧，DNA聚合酶沿相反方向移动，导致先导链连续合成，而后随链以断续方式合 成。这种方向性确保了DNA复制的高效性和准确性。先导链的连续合成和后随链的分段合 成是对DNA双螺旋反向互补性的一种适应。 2.DNA 复制的机制 DNA复制是一个高度精确和复杂的生物学过程，涉及多个步骤和一系列专门的酶。这个 过程确保遗传信息在细胞分裂时被精确复制并传递给子代细胞。 DNA复制始于特定的DNA区域，被称为复制起点( origins of replication)。这些区域通常 含有丰富的A-T 碱基对，因为A-T 间的氢键较G-C间的氢键更易于断裂，有利于DNA双螺 旋解旋。在复制起点处，酶类复合物识别并解开双链DNA, 形成所谓的复制叉。这是DNA 复制的活跃区域，新的DNA链在此合成。解旋酶( helicase) 在复制叉处沿DNA双链移动， 断裂氢键，使两个单链DNA分离。它的活动需要能量，通常来自ATP的水解。通过解旋酶 的作用，双螺旋DNA 被打开，形成两个单链DNA模板，准备进行新链的合成。拓扑异构酶 (topoisomerase) 在DNA复制中通过调节DNA的拓扑状态，解决复制过程中产生的超螺旋张 力，确保DNA的正常复制和分离。DNA复制过程中，DNA双螺旋的解开会引入正向或负向 的超螺旋张力，这种张力如果不加以调整，会阻碍复制叉的进展，甚至可能导致DNA断裂。 单链结合蛋白( single-strand binding protein, SSB) 紧密地结合在分离的单链DNA上。SSB 的作用是保持DNA模板的稳定性和可读性，防止单链DNA重新形成双螺旋结构或受到核酸 酶的降解，为后续的复制提供必要的条件。引物酶( primase) 的主要功能是合成短的RNA 引物，为DNA聚合酶提供起点。这个RNA引物具有自由的3'羟基，使得DNA聚合酶能够 在其基础上进行链延伸。随后，这些引物会被移除并替换为DNA序列。DNA聚合酶在引物 的3'端添加适配的核苷酸，合成新的DNA链。它具有校对功能，以确保复制的准确性。在 先导链上，DNA复制连续进行；而在后随链上，由于双链DNA的反向互补性，复制以断续 方式进行，形成冈崎片段( Okazaki fragments)。DNA连接酶( DNA ligase)负责将冈崎片段 间的间隙连接起来，形成连续的新DNA链。这一步骤是DNA复制过程中确保新合成链完整 性的关键环节，特别是在后随链的复制中尤为重要(图1.25)。 图1.25 DNA 复制机制。 3.DNA 复制的调控 DNA复制的调控是确保遗传信息准确、稳定传递的关键。这个过程涉及复杂的调控机 制，包括复制的启动、准确性保证及复制的时序控制。 DNA复制始于复制起点。这些区域通常富含特定序列，易于解开双链DNA。一系列起 始蛋白识别并结合到复制起点，启动复制过程。这些蛋白质包括复制起始因子和解旋酶复合 体。复制起始后，多种蛋白质和酶在复制叉处组装成一个大的复合体，共同参与DNA链的 解开和新链的合成。 DNA聚合酶不仅负责新链的合成，还具有校对活性。其3'-5'外切酶活性能够识别 并纠正合成过程中的错误，通过删除错误的核苷酸并替换正确的核苷酸来维持复制的准确 性。若DNA聚合酶的校对功能未能修正错误，细胞还具有其他DNA修复机制，如错配修复 (mismatch repair),以纠正复制过程中的错误。保持高复制忠实度对于避免遗传突变和保持遗 传稳定性至关重要。复制错误若未被修正，可能导致遗传疾病或细胞癌变。 DNA复制严格发生在细胞周期的S 阶段(合成期)。这一阶段之前的G1期和之后的G2 1.3 核酸的生物学功能 I 21 期分别负责准备复制和后续的细胞分裂。复制的时序受到一系列细胞周期蛋白(如周期蛋白 和周期依赖性激酶)的严格调控。这些蛋白质确保DNA在每个细胞周期只被复制一次。启 动复制后，复制起点变得不活跃，以防在同一个细胞周期内重复启动。这种机制称为复制许 可( licensing) 和抑制。在DNA损伤或复制叉阻塞时，细胞会触发复制应激反应，以保持 复制过程的稳定性。这些反应包括暂停复制、激活DNA损伤修复途径和调整细胞周期进程， 以允许细胞有更多时间修复损伤。复制应激反应对于维护细胞的遗传稳定性和防止遗传信息 的不正确传递至关重要。 4.DNA复制的意义 DNA复制在生物学上具有深远的意义，它不仅是遗传信息传递的核心机制，也是维持生 命过程的基础。这一过程对于生物体的生长、发育、再生，以及遗传多样性的产生都至关重 要。DNA复制保证了遗传信息从一代细胞准确地传递到下一代细胞。这种高度保守的复制过 程是遗传稳定性的基石。复制过程中，所有基因都被复制到新的DNA分子中，确保每个细 胞都具备完整的基因组，为表达生物体所需的各种蛋白质和RNA提供基础。DNA复制的高 准确性减少了遗传疾病由于复制错误而产生的风险，保持了遗传信息的纯洁性。DNA复制是 细胞生命周期中的关键环节，每次细胞分裂前都必须完成DNA的复制。在生物体的发育过 程中，DNA复制支持了从胚胎发育到成体形成的各个阶段，是形成新细胞和组织的前提。 虽然DNA 复制是一个高度准确的过程，但偶然的复制错误(突变)为生物的适应性进 化提供了原始材料。突变导致的遗传变异是物种多样性的基础。这些变异可能导致新的性状 出现，帮助生物适应环境变化。在自然选择的作用下，有益的变异被保留并传递给后代，促 进了生物种群的适应性和多样性。 DNA复制过程中的错误若未被及时修复，可能导致细胞失控增殖，增加癌症的风险。对 DNA复制机制的研究有助于理解某些遗传病的发生机理，为疾病的预防和治疗提供新的视 角。在基因工程领域，利用DNA复制的原理可以进行基因克隆和基因表达研究。基于DNA 复制的技术，如聚合酶链式反应( PCR), 在分子诊断和疾病检测中扮演着重要角色。 1.3.2 RNA 的转录与加工 RNA转录和加工是基因表达的关键步骤，涉及将DNA中的遗传信息转录为RNA, 以及 对转录后RNA的修饰。这些过程确保遗传信息正确转换为功能性蛋白质。 1.RNA 转录过程 RNA转录是遗传信息从DNA转移到RNA的 关键步骤，涉及一系列精确的生物化学过程(图 1.26)。这一过程在基因表达和调控中起着至关重 要的作用。在原核生物中，转录起始于DNA上的 特定区域，称为启动子。这些区域通过其特有的 核苷酸序列被转录因子及RNA聚合酶识别。转录 因子是一类专门的蛋白质，它们识别并结合到启 动子上，辅助RNA聚合酶精确地定位到启动位 点。RNA聚合酶与转录因子一同形成一个稳定的 图1.26 DNA 转录成RNA。 转录起始复合体，开始合成RNA。RNA 聚合酶沿DNA模板链以5'-3'的方向合成RNA, 同 步读取DNA模板并添加与之互补的核苷酸。RNA聚合酶的方向性确保了RNA合成的正确 性，防止错误的核苷酸序列合成。转录终止于特定的终止序列，此时RNA聚合酶停止合成 并从DNA模板解离。 相比之下，真核生物的转录机制更为复杂，涉及多种类型的RNA聚合酶及更为详细的 调控机制。转录同样起始于特定的启动子区域，但通常需要一组更复杂的转录因子来引导 RNA聚合酶Ⅱ结合并启动转录。真核生物中的RNA转录还包括对新合成的前体mRNA(pre- mRNA)的加工，如剪接去除内含子、加入5'端帽和3'端poly-A尾。这些加工过程对于成熟 mRNA的稳定性和翻译至关重要。与原核生物相同，转录在遇到特定终止信号后结束。 RNA转录是基因表达的第一步，决定了哪些基因被激活，并在多大程度上被激活。通过 调节特定基因的转录，细胞可以专门化其功能，实现分化和发育。 2.RNA加工过程 RNA加工是遗传信息从DNA转化为功能性蛋白质的关键中间步骤，尤其在真核生物中 扮演着重要角色。mRNA 5' 端帽加工，通过在新合成的前体mRNA分子上添加一个保护性的 帽状结构来增强mRNA的稳定性、成熟度及翻译效率；3'端多聚腺苷酸化，通过在RNA分 子的3'端添加聚腺苷酸尾部来提高mRNA的翻译效率和稳定性。此外，RNA分子可以通过 甲基化、假尿苷化等多种化学修饰进行修改，影响其结构和功能。 在真核生物中，一旦RNA聚合酶开始转录，新合成的RNA的5'端会被迅速加上一个特 殊的化学结构，称为5′帽(图1.27)。这个结构通常是一个N⁷-甲基鸟嘌呤核苷酸( m²G) 。5' 帽对于mRNA的稳定性至关重要，它保护RNA不被细胞内的核酸酶降解。此外，5′帽也是 mRNA识别和结合到核糖体的信号，对于后续的蛋白质翻译过程至关重要。5'帽的加入通常 与转录过程紧密协调，确保新合成的RNA在加工和功能化过程中得到有效保护。 图1.27 RNA5′ 帽结构。 在真核生物中，新合成的前体mRNA(pre-mRNA) 包含编码蛋白质的区域(外显子) 和非编码区域(内含子)。外显子是最终表达的基因序列，而内含子在成熟mRNA中不出现。 RNA剪接是一个精确的细胞过程，由剪接体( spliceosome)完成。在这个过程中，内含子被 移除，外显子相互连接，形成连续的编码序列(图1.28)。剪接体是由多个核内小RNA 1.3 核酸的生物学功能 |23 图1.28 RNA剪接过程。 (snRNA) 和蛋白质复合体组成的，负责识别剪接位点、切割内含子及连接外显子。 选择性剪接是指一个基因在不同的细胞类型或不同的发育阶段产生不同的mRNA变体。 通过在剪接过程中包含或排除特定的外显子，一个基因可以编码多个不同的蛋白质。通过选 择性剪接，细胞能够增加其蛋白质产品的多样性，使得一个基因可以在不同的生理和环境条 件下发挥不同的功能。 在真核生物中，前体mRNA的3'端会被添加一串由腺苷 酸组成的序列，称为poly-A尾(图1.29)。这个过程通常在 RNA剪接完成后进行。poly-A尾的加入对于增强mRNA的稳 定性和促进其从核到细胞质的导出具有重要作用。它还参与 调控mRNA的翻译效率。poly-A尾的加入是mRNA成熟和功 能化的最后步骤之一，对于mRNA在细胞内的有效利用至关 重要。 RNA 加 工 是 基 因 表 达 调 控 的 重 要 环 节 ， 通 过 对 前 体 图 1 . 2 9 RNA 加尾过程。 mRNA 的 加 工 ， 细 胞 能 够 控 制 特 定 基 因 产 品 的 表 达 和 功 能 。 RNA加工过程使得细胞能够快速地对内外环境的变化作出反应，通过改变mRNA的加工方 式来调整蛋白质的产量和类型。RNA加工的异常与许多疾病相关，包括某些遗传性疾病、癌 症和神经退行性疾病。因此，对RNA加工机制的深入理解有助于疾病的诊断和治疗。 RNA加工是从基因到蛋白质的关键转换过程，在生物体的基因表达和调控中扮演着重要 角色。通过一系列精确的生物化学步骤，前体mRNA被处理成成熟的mRNA,为蛋白质的合 成提供了必要的前提。 3.RNA加工的生物学意义 RNA加工在基因表达调控、增加蛋白质多样性及确保mRNA的有效运输和翻译中起着 至关重要的作用。RNA加工的异常与许多疾病相关，包括遗传性疾病、癌症和神经系统疾 病。对RNA加工机制的了解有助于发现和治疗这些疾病。RNA加工的细微变化可以作为 诊断某些疾病的生物标志物。同时，针对RNA加工的干预策略正在被开发为潜在的治疗方 法。通过分析RNA加工模式的变化，科学家可以更好地揭示疾病的分子机制和潜在的治疗 靶点。 1.3.3 RNA 修饰、翻译 1. RNA修饰 早在1960年，科学家就注意到细胞内RNA中除了A,U,C,G 四种天然的碱基外，还 存在被修饰的碱基。1965年，科学家完成了首个天然的RNA分子——酵母丙氨酸tRNA—— 的测序，在该tRNA上鉴定出了包括假尿苷( V) 在内的10种修饰类型(图1.30)。目前，已 经从生命体中发现了100多种RNA合成后修饰类型，大部分修饰位于碱基上 ，也有部分修 饰位于核糖和磷酸二酯键上。 N⁶ -甲基腺苷 N¹- 甲基腺苷 次黄嘌呤( I) 假尿苷(ψ) 2'-0-甲基 图1.30 真核生物mRNA 中常见的化学修饰。 常见的RNA修饰包括N⁶- 腺苷酸甲基化( m⁶A) 、N¹-腺苷酸甲基化( m¹A)、次黄嘌呤、 假尿苷、2'-0-甲基化等(图1.30)。RNA修饰具有重要的生物学功能，参与多种人类疾病的 发生和发展。 m⁶A是 mRNA中除了5'-m²G帽子结构外，丰度最高的甲基化修饰形式，在细胞mRNA 中占总腺苷残基的0.1%~0.4%, 平均每个转录本有2~3个m⁶A 位点。早在20世纪70年代 就在哺乳动物mRNA中发现了m⁶A 修饰，但是未引起足够的关注。2009年，芝加哥大学的 Chuan He发现了FTO蛋白对m⁶A的去甲基活性，证明了该修饰具有动态可逆的特性，是一 种RNA水平的表观遗传修饰，进而引起了对m⁶A的动态分布和功能进行研究的热潮。mRNA 上m⁶A修饰倾向于发生在保守基序RRACH(R=G或者A;H=A,C 或者U) 中。在人类和 小鼠中，m⁶A 修饰主要分布在转录起始区、编码区和3'非翻译区，特别是在编码区的终止密 码子附近及3'非翻译区的前1/4处显著富集。甲基转移酶(书写蛋白，writer protein)和去甲 基化酶(擦除蛋白，eraser protein) 共同调节m⁶A 修饰的动态变化。m⁶A识别蛋白则通过与 m⁶A修饰的结合，调控mRNA的功能和命运。比如m⁶A结合蛋白YTHDF1能够提高靶RNA 的翻译效率；YTHDF2通过与m⁶A修饰结合，加速mRNA的降解；m⁶A修饰通过多种方式 影响mRNA的生物学功能，包括促进mRNA的出核、参与选择性剪接及前体miRNA的处理 等。此外，m⁶A 修饰还与细胞分化、生殖细胞发育等关键生物学过程，以及肿瘤、肥胖等多 种疾病的发生相关。假尿嘧啶被认为是RNA的第5个碱基，是RNA上最丰富的修饰类型之 一，主要集中在tRNA,rRNA,snRNA 和mRNA上。假尿嘧啶的生成依赖两类假尿苷合成酶 ( pseudouridine synthases, PUSs): 不需要共因子( cofactor) 的“stand-alone”假尿苷合成酶 和H/ACA box snoRNA 协助识别靶RNA的假尿苷合成酶。目前已在mRNA上鉴定了约2000 个假尿苷位点，而根据质谱检测结果，mRNA上的假尿苷修饰丰度应该和m⁶A相当。2006 1.3 核酸的生物学功能 25 年，Karikó Katalin和Drew Weissman发现假尿 苷修饰能够降低mRNA在真核细胞中的免疫原 性。这一发现为mRNA疫苗的临床应用扫清了 最大的障碍，mRNA疫苗在战胜新冠肺炎疫情 方面发挥了重要作用。Katalin和Weissman因 此获得2023年诺贝尔生理学或医学奖。 相较于其他类型的RNA,tRNA 所含修饰 的程度最高，修饰的种类最多。哺乳动物的 tRNA有接近1/5的核苷酸是被修饰的。真核 细胞的tRNA上有超过50种独特修饰。tRNA 上的这些修饰在tRNA的识别、定位和二级 结构的折叠中起到了至关重要的作用。例如， tRNA中的34号位对应反密码子的1号位。将 tRNA第34位腺嘌呤脱去氨基后得到次黄嘌呤 (hypoxanthine,I), 能够同时与U,A,C 配 对，实现了密码子的简并。tRNA的37号位是 反密码子的相邻位。将tRNA的37号位修饰 为怀丁苷(wybutosine,yW), 修饰后的碱基 无法与其他碱基配对，这既避免了密码子-反 次黄嘌呤( I) 怀丁苷( yW) 图1.31 tRNA 的化学修饰。 密码子配对的漂移，也有利于保持反密码子处于非配对的开放状态(图1.31)。 2. RNA的翻译过程 翻译是细胞利用核糖体以mRNA的信息合成蛋白质的过程。翻译过程可分为三个阶段： 起始、延伸、终止。在起始阶段，mRNA结合核糖体和起始密码子对应的tRNA; 在延伸阶 段，氨基酸依序连接在延展的多肽链上；在终止阶段，核糖体释放mRNA及合成的多肽。原 核生物与真核生物在转录的各个阶段存在差异。 多肽合成的起点是对初始密码子的识别。在大多数情况下，起始密码子为AUG,但 在 细菌中，也可能出现GUG或 UUG, 这三种起始密码子对应的氨基酸均为甲硫氨酸。而在翻 译过程中，实际上存在两种甲硫氨酸tRNA, 一种专门用于识别起始密码子( AUG,GUG, UUG), 表示为tRNA“, 另一种用于识别内部的AUG密码子，表示为tRNAM=。在原核生物 中，与起始密码子相对的tRNA 所携带的甲硫氨酸的氨基会被甲酰化修饰，表示为fMet- tRNA, 使其无法参与肽链的延长，这能保证识别起始密码子的tRNA不会误用在内部。在 真核生物中，起始密码子对应的tRNA“ 则并未甲酰化，依靠辅助因子识别两种甲硫氨酸 tRNA。虽然所有的多肽合成均以甲硫氨酸为N 端的起始氨基酸，但并不是所有的多肽均会 保留起始甲硫氨酸，有些多肽会在翻译后修饰阶段去除该氨基酸。 在翻译起始时，在多个翻译起始因子的协助下，参与翻译过程的核糖体小亚基、mRNA、 tRNA 、50S 大亚基分步有序组装成起始复合体。初始步骤结束后，会依照mRNA上的序列 信息开始延伸肽链。延伸反应在进化过程中极其保守，无论是真核生物还是原核生物基本相 同。二者都需要3个延伸因子( elongation factor,EF),原核生物的3个延伸因子为EF-Tu, EF-Ts 和EF-G, 真核生物的3个延伸因子为eEF1A,eEF1B 和eEF2, 原核与真核的延长因 子一一对应。真核生物延伸过程相较于原核生物最大的不同在于真核生物核糖体无结合空载 tRNA的E 位点，脱去氨基酸残基的tRNA直接从P 位脱落。 肽链的延伸反应为三步循环，每次循环增加一个氨基酸残基。以原核生物为例，第一 步：氨酰-tRNA结合到核糖体A位点。EF-Tu, 氨酰-tRNA和 GTP组成复合体，进入核糖体 A位，若该氨酰-tRNA的反密码子与A 位的mRNA 密码子相对应，则核糖体构象发生变化， 使其与tRNA的结合变得稳定，并引发GTP的水解( EF-Tu 具有GTP水解酶活性)。此时， 氨酰-tRNA的氨基酸受到大亚基的肽基转移酶催化，二元复合体EF-Tu·GDP 被释放。第二 步：转肽反应。转肽反应由23SrRNA催化，本质是将P 位点tRNA上的氨基酸残基转移到A 位点氨酰-tRNA氨基上。第三步：核糖体移位。转肽反应发生后核糖体从mRNA的5'端向 3'端移动一个密码子，以便开启下一个循环(图1.32)。 图1.32 原核生物多肽合成的延伸过程。 在肽链的起始过程与延伸过程中，mRNA上密码子的识别均由tRNA进行。然而，虽然 存在终止密码子( UAA,UGA,UAG), 但并不存在识别终止密码子的tRNA, 终止阶段的密 码子识别需要释放因子( release factor,RF) 的参与。当终止密码子出现在A位点时，释放 因子与终止密码子结合，这会活化肽基转移酶。但与延伸阶段不同，释放因子并不具有转肽 所需的氨基酸残基，此时水分子会参与反应并将肽链水解下来。 1.3.4 非编码 RNA 非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)是指不参与蛋白质编码的RNA总称。除rRNA, 1.3 核酸的生物学功能 27 tRNA, snRNA( small nuclear RNA,核内小RNA) 等ncRNA外，近年来还发现了siRNA(small interference RNA,小干扰RNA)、miRNA(microRNA, 微小RNA) 和lncRNA(long noncoding RNA,长链非编码RNA) 等调控型ncRNA,它们作为细胞的调控因子，参与了从基因沉默 到RNA分子的剪切与修饰，到信号转导等多种生命活动过程，形成了细胞中高度复杂的 RNA调控网络。人体基因组中98%的转录产物都是ncRNA。目前，绝大多数的ncRNA的功 能未知，需要进一步探索。 1.siRNA siRNA是一种长度为21~23对核苷酸的双链RNA分子。siRNA 的核苷酸序列与所作用的靶mRNA具有同源性，其两条链末 端均为5'端磷酸和3'端羟基，且3'端各有2~3个凸出的核苷 酸，这是细胞赖以区分真正的siRNA和其他双链RNA的结构基础 (图1.33)。 siRNA主要通过RNA干扰( RNA interference,RNAi) 来发挥 其生物学功能。RNAi中，长的双链RNA首先在Dicer(RNAase Ⅲ 2 nt悬臂 正义链 反义链 19 nt二聚体 识别区(2-8nt) 裂解位点 图1.33 siRNA的结构。 家族中的核糖核酸酶)的作用下产生siRNA。包含Argonaute蛋白的蛋白复合体能够解开该 RNA 双链，并与其中的一条RNA链形成RISC(RNA-induced silencing complex)。RISC复合 体中的单链RNA通过与靶mRNA 配对形成双链，诱导Argonaute蛋白对靶mRNA进行位点 特异性切割，导致基因沉默效应(图1.34)。目前，已经有多种siRNA 药物获美国食品药品 监督管理局( Food and Drug Administration,FDA)批准上市，用于治疗高胆固醇血症、遗传 性转甲状腺素蛋白淀粉样变性等疾病。 图1.34 siRNA 介导的RNA i。 2.miRNA miRNA是在真核生物中发现的一类内源性的具有转录后调控功能的ncRNA。miRNA生 成的过程主要经历两个关键步骤(图1.35),一是在细胞核里将miRNA基因转录并加工成大 约70个核苷酸长的前体miRNA(pre-miRNA); 二是将这些前体miRNA转运至细胞质，在 那里由Dicer酶加工为成熟的miRNA。 成熟的miRNAs组装进RNA诱导的沉默复合物后通过碱基互补配对的方式识别靶 图1.35 miRNA 的生成及作用机制。 mRNA,当miRNA与靶mRNA之间不完全配对时，miRNA阻遏靶mRNA的翻译，当miRNA 与靶mRNA之间完全配对时，miRNA指导沉默复合物降解靶mRNA。miRNA在细胞生长和 发育过程中发挥多种调节作用。目前仅有部分miRNA的功能已经明确，许多miRNA的功能 还尚待研究。 3.IncRNA IncRNA是一类长度超过200个核苷酸的单链RNA分子，是数量最为庞大的一类非编码 RNA。IncRNA通过与DNA,RNA 和蛋白质相互作用来调控生命过程，其功能主要有以下几 个方面：①通过与染色质重塑复合物和组蛋白修饰酶的相互作用，调节染色质的开放状态 和基因的表达。②通过与mRNA和其他非编码RNA相互作用，调控mRNA的转录后加工、 转运和翻译。目前已经知道一些lncRNA的具体功能，但更多lncRNA的作用机制还不明确， 这与缺乏lncRNA结构与功能研究的有效手段有关。 4.RNA 的催化作用及核酶 在发现核酶( ribozyme) 之前，基于RNA能形成与蛋白质 相同的高度有序的二级结构，RNA就已被认为具有催化活性。 1982年，Thomas R.Cech团队发现的四膜虫I 型内含子能够自 我催化实现剪接，证实了RNA具有催化活性这一观点。核酶 是核糖核酸酶的简称，指的是具有催化能力的RNA分子。核 酶是一种催化中心完全由RNA组成的酶，因此不需要蛋白质 来催化(尽管许多核酶以RNA-蛋白质复合物的形式自然存 在)。在随后的40多年中，已经鉴定出10多种核酶，包括I 型 内含子、Ⅱ型内含子、RNase P 、Hammerhead 、Hairpin 、HDV、 Neurospora VS等，能够催化RNA链的断裂、磷酸酯交换、肽 基转移等多种反应。 通过体外的进化筛选，科学家还发展了一系列功能多 样的非天然核酶，以及能够识别并结合靶标分子的核酸适体 (aptamer) 。1994年，Gerald Joyce证实DNA单链也具有催化功 能。他通过体外筛选，发现了一种能够催化RNA裂解的单链脱 氧核酶( DNAzyme, 图1.36)。 核糖开关( riboswitch) 是细菌mRNA的5'-非翻译区一段具有调节功能的区域，它 可以与小分子代谢产物结合而改变构象，从而调控基因表达。核糖开关通常由两部分 组成——进化上保守的代谢产物感应“适体”结构域和携带基因表达信号的相邻可变的 “表达平台”(图1.37)。核糖开关利用许多不同的RNA适体结构来选择性地识别各种配 体。这些适体与相邻的表达平台相互作用，控制转录终止、翻译起始或相关RNA的剪接 以调节基因表达。近年来，发现核糖开关最有效的策略是使用计算机算法对细菌基因组 的非编码DNA部分进行比较序列分析。此外，生物信息学算法可用于寻找许多新的候选 核糖开关。 1.4 核酸的物理和化学性质 I 29 图1.37 典型核糖开关的结构域。结构域包括代谢产物感应适体结构域、表达平台和ORF (open reading frame); 代谢产物( M) 结合稳定了核糖开关结构域的构象。 |1.4 核酸的物理和化学性质 1.4.1 核酸热变性与分子杂交 核酸在生物体内承担着存储和传递遗传信息的关键角色，其结构和功能受到众多因素的 影响，其中核酸的热变性和复性是两个关键特征。不同于蛋白质的变性可导致其功能无法恢 复，核酸能作为遗传物质的最重要特性在于变性后可以自主恢复其二级和三级结构。基于核 酸的这种特性，引入与核酸序列特异性配对的同源DNA或RNA寡聚核苷酸进行核酸分子间 杂交，可以实现对核酸的鉴定和功能调控。 1. 核酸的热变性和复性 核酸的结构是由碱基对之间的氢键相互作用和碱基堆积作用维持的，而这些氢键在高温 下会变得不稳定，导致核酸分子发生解链。核酸的热变性是指核酸在高温下双螺旋结构逐渐 松弛，碱基对分离，形成两条单链，从而失去其二级和三级结构的过程(图1.38)。通常我 们用核酸双链解链一半时的熔解温度T 来表示核酸双链的热变性温度。DNA的热变性熔解 熔解 退火 T —G -A- T一 3' —C-G- 3' 5' 3' 图1.38 核酸的热变性和复性的过程。 30 I 第一章 核酸 温度/℃ 图1.39 核酸双链的熔解曲线及Tm值。 温度T 较RNA的热变性熔解温度稍高，通常发生在60~90℃ 的温度范围内。核酸的这个过程在许多生物学过程中(诸如 DNA复制和转录)发挥着关键的作用。 与热变性相对应的是核酸的复性。复性通常是指在冷却 过程中，已经发生热变性的核酸分子重新形成二级和三级结 构的过程(图1.38)。重新结合的过程依赖于碱基间的互补配 对，即腺嘌呤( A) 与胸腺嘧啶( T) 之间形成两个氢键，而 鸟嘌呤( G) 与胞嘧啶( C) 之间形成三个氢键。 通常情况下，核酸双链的配对序列越长，核酸的热稳定 性越高，熔解温度T.值越大。同时由于双链中G-C 和A-T 碱基间不同的氢键，相同碱基数的双链核酸序列的热稳定性 也受到G-C 和A-T比例影响。G-C 比例越高，核酸的热稳定 性越高，熔解温度T. 值越大。此外，溶液的pH、离子强度、 阳离子类型、溶剂等也是影响核酸双链稳定性的环境参数。 目前检测核酸双链热稳定性最常用的方法是核酸双链的熔解曲线(图1.39)。即从温度 诱导转变(熔解)曲线，可以评估热力学参数△H,△S 和△G。原理是van'tHoff方程： 式中，K 是核酸熔解过程中的过渡平衡常数，T 是热力学温度，△H 是 van'tHoff 焓变。若α 为双链( ds) 态链浓度和总链浓度( c) 的比值，则平衡常数K可以用α和c 表示，上述等 式可变换为 △H=aRT²(da18T) 在这里，常数a 对于涉及互补或自相互补寡聚物的分子间双螺旋形成等于6,对于分子内双 螺旋形成等于4。通过在熔解温度T ( 其中α=0.5)处取(α/T) 值，可以从上述方程计算 △H,H 目前核酸双链熔解曲线有两种不同的测量方法，即光密度( OD) 与温度的关系和直接 量热法。前一种方法基本上只适用于在解链过渡过程中没有过多中间状态的两状态过程，特 别适合于较短的寡核苷酸，而不是长链寡聚核苷酸。对于存在多态转变的核酸双链解链过 程，直接量热法提供了最可靠的结果。目前有两种直接量热技术，等温混合量热法和更常见 的差示扫描量热法。 2.核酸分子杂交和应用 核酸的热变性和复性是生物学中一对密切相关的过程，不仅在生物体内发挥关键作用，也 为实验室科学研究提供了强大的工具。对这两个过程的深入研究不仅有助于揭示核酸的结构和 功能，还为分子生物学和生物医学研究提供了有力的支持。基于核酸的这一特性可以通过核酸 链之间的分子杂交实现DNA和RNA序列的同源性检测。分子杂交是DNA和/或RNA 之间相 互结合，形成具有新的遗传信息的杂交分子的过程。通常情况下，两条核酸单链( DNA或 RNA) 混合后，在适当的温度和盐浓度下两条单链上的碱基按照A-T/U和C-G 互补的规则 1.4 核酸的物理和化学性质 I 31 结合，分别形成两个氢键( A-T/U) 和三个氢键( C-G), 最终形成一个核酸双链的分子。这 种特异性的核酸单链之间的杂交过程确保了其重新结合的稳定性和特异性。 分子杂交是一种重要的生物学技术，模拟了生物体内DNA的复制和重结合过程，广 泛应用于分子生物学、基因工程和遗传学等领域。通过这一技术，科学家们能够深入研究 目标基因结构和功能，由此推动基因工程、医学诊断、基因治疗等领域的发展。例如，在 Northern Blot 实验中，DNA或RNA 探针与目标RNA杂交实现目标RNA分子在细胞中的定位 和定量分析，这有助于研究特定基因表达的水平和模式。而基因检测是核酸分子杂交的最重 要应用之一。通过向DNA探针链引入放射性或荧光标记，可以追踪和探测特定DNA片段， 检测特定基因和特定物种DNA的存在。 分子信标( molecular beacon, MB) 最早由罗格斯( Rutgers) 大学的Sanjay Tyagi 教授提出。其结构一般包括四个部分( 图1.40): ①环状区：一段长度为15~30个碱基的 目标识别区域，与待测核酸序列互补配对；②茎干区：两段长度为5~8个碱基的互补 序列；③荧光基团：一般连接在MB的5'端；④猝灭基团：连接在MB的3'端。在没有目 标序列时，MB构成一个发夹结构，荧光基团和猝灭基团彼此紧邻，荧光基团受激发后将能 量转移给猝灭基团，最终以热的形式散发，无荧光。当遇到目标检测序列时，MB环状区与 之配对，形成的双螺旋结构比发夹结构更稳定，发夹结构被打开后猝灭基团与荧光基团 分离，产生荧光信号，从而实现对特定核酸序列的高度选择性检测。分子信标具有高灵敏 度、高选择性、适于活体检测等优点，可用于体外试剂盒检测(致病基因突变和病毒核酸 的检测),甚至用于活细胞水平上的靶标核酸胞内定位和动态检测等研究领域。 图1.40 分子信标( MB) 结构及其检测原理。 1.4.2 核酸的化学稳定性及其影响因素 1. 核酸的化学稳定性 生物体内的遗传信息传递、复制和表达过程都依赖于核酸的化学稳定性。核酸化学稳定 性及其影响因素对于理解生命的基本过程和应用核酸技术具有重要的意义。核酸的化学稳定 性从结构上分析主要包括以下几点： (1)糖苷键的稳定性：糖苷键连接着核苷酸中的糖环结构和碱基基团，形成核酸中的核 苷骨架。这种糖苷键的稳定性对于整个核酸分子的结构至关重要，而糖苷键本身的内在特性 使其在酸性和碱性条件下均不稳定，可发生脱嘌呤和脱嘧啶现象。 32 I 第一章 核酸 (2)碱基的稳定性：核酸双链碱基之间的氢键是维持核酸双链结构稳定性的重要因素。 互补碱基对之间的氢键决定了核酸的结构稳定性，腺嘌呤( A) 与胸腺嘧啶( T) 之间形成两 个氢键，而鸟嘌呤( G) 与胞嘧啶( C) 之间形成三个氢键。碱基在活性氧作用下可以发生氧 化反应，如鸟嘌呤可以被氧化成8-氧-鸟嘌呤，以及相邻嘧啶碱基在紫外光作用下发生二聚 反应，均可导致核酸的不稳定性。 (3)磷酸二酯的稳定性：磷酸二酯是核酸中连接核苷酸的糖环之间的骨架，是核酸的一 个重要组成部分。磷酸二酯基团的负电荷是核酸具有水溶性的关键，但同时磷酸二酯键在酸 性或碱性条件下会水解的特性使得核酸骨架变得不稳定。特别地，RNA的核苷酸还可以发生 核糖2'位羟基参与的磷酸骨架酯键的酯交换反应，导致RNA链断裂。 2. 核酸化学稳定性的影响因素 (1)温度的影响：温度是影响核酸稳定性的主要因素之一。双链核酸相对于单链核酸具 有更高的稳定性。较高的温度会增加核酸分子的热运动，导致热变性，即DNA或 RNA的双 链结构解开，暴露的单链核酸的糖苷键和磷酸二酯键在高温下均不稳定。因此，核酸在生物 体内通常需要在体温下保持稳定；而长期保存通常需要在-80℃。 (2) pH的影响：酸性或碱性条件均可能破坏核酸的稳定性，主要表现在核苷酸的脱嘌 呤和脱嘧啶的现象。在极端酸性或碱性条件下，负电荷的磷酸二酯也将失去稳定性，导致核 酸链断裂。由于RNA核酸分子糖环2'位的羟基作用，RNA核酸的稳定性更差。因此，核酸 在中性或近中性的pH 下最为稳定。 (3)离子的影响：核酸本身是带负电荷磷酸酯的骨架，在中性环境下需要阳离子平衡核 酸的负电荷。阳离子的存在有助于屏蔽磷酸二酯的负电荷，从而维持核酸的稳定性。适当的 离子浓度对于DNA和RNA的结构稳定性及生物功能至关重要。同时，不同的离子，特别是 重金属离子对核酸稳定性和核酸功能具有很大的影响，如铜离子可以加速磷酸二酯键水解， 导致核酸不稳定；含金属铂药物(如顺铂)可以与核酸相邻嘌呤作用，导致核酸结构变化， 影响核酸的功能，达到药物治疗的作用。 (4)辐射的影响：紫外辐射和其他类型的辐射都可以损害核酸的结构，导致碱基损伤和 核酸链断裂，从而降低其结构的稳定性。例如，紫外辐射诱导的相邻胸腺嘧啶二聚，以及X 射线诱导的碱基突变或氧化均可以导致基因组突变。生物体内的修复系统通常能够修复这些 损伤，但过度辐射可以导致人体器官损伤及肿瘤的发生。 (5) 酶的影响：在生物体内，存在许多核酸内切酶和核酸外切酶，其中包括DNA酶和 RNA酶，它们分别特异性地降解相应DNA和RNA。这些酶在细胞内起到维持基因组稳定性 的作用，但也可能导致正常功能核酸的过度降解。 3. 核酸的保存和处理 由于核酸本身内在的稳定性问题，核酸的保存和处理直接影响实验结果的准确性和可重 复性。合适的保存和处理方法能够确保核酸的完整性、稳定性及防止外源污染。 细胞中的DNA由于和组蛋白结合形成稳定的复合物而具有很高的稳定性，而RNA在细 胞内的转录合成和代谢降解的平衡下维持在一定正常的稳态水平。如前所述，温度对核酸的 稳定性具有至关重要的影响。裸露的核酸因为没有结合蛋白的保护，在正常温度下会发生缓 慢降解。DNA和RNA通常需要冻干低温保存。如果是DNA和RNA的核酸溶液，通常建议 在-20℃或更低的温度下进行冷冻保存，这有助于减缓核酸降解的速率，保持其完整性。此 1.4 核酸的物理和化学性质 133 外，在核酸溶液中加入一些冷冻保护剂也有助于提高核酸的稳定性，其中海藻糖作为一种冷 冻保护剂，可以提高核酸(特别是组织细胞中的核酸)在低温保存过程中的保护能力和稳定 性。与此同时，合理分装和储存核酸样品可以避免多次冻融核酸样品导致核酸的降解。对于 更长时间的保存或重要的核酸样品，-80℃或液氮保存是更佳的选择。在液氮罐中存储可以 确保核酸的长期高稳定性。 核酸酶污染是核酸保存和处理过程中的关键因素，特别是环境中广泛存在的RNA核酸 水解酶。所有核酸相关的实验操作都应该在干净的实验室条件下进行，避免污染，特别是 RNase和DNase的污染。同时，实验过程中需要使用无RNase试剂、耗材和工具，以防RNA 的降解。 核酸的保存和处理对实验结果的准确性和可重复性有着直接的影响。实验中应遵循相关 的实验规程和生物安全操作，以确保核酸样品的准确性和可靠性，为分子生物学和遗传学研 究提供可靠的基础。 1.4.3 常见的DNA 损伤反应 人体中多达10¹³个细胞中，DNA损伤时刻发生着。DNA损伤会对细胞基因组的稳定性 及复制和转录产生影响。没有被及时修复或者错误修复的损伤DNA如果被复制和转录，会 使基因组出现突变或基因组畸变，诱导细胞或生物体死亡或促使癌细胞和肿瘤产生。此外， 生物体与环境中各种污染物、毒性物质和重金属接触等引起的水解反应、氧化还原反应，每 天都会损伤大量的DNA 碱基。细胞在应激条件下产生的活性氧和活性氮化合物，能够与 DNA发生化学反应并生成加合物。这类DNA加合物可能干扰DNA基因组中的碱基配对，阻 断DNA复制和转录，还会诱导DNA中碱基丢失和/或DNA单链或双链断裂。 常见的DNA损伤包括以下几种类型。 1. UV引发的嘧啶二聚 紫外线( ultraviolet,UV) 属于诱导DNA损伤最为常见的环境因素。UV辐射是一种高 能辐射，它能够诱导DNA分子中的相邻嘧啶碱基形成具有特殊结构的损伤。这种结构形成 的机制涉及UV 辐射激发DNA中的相邻嘧啶碱基发生[2+2]环加成反应或[2+2]环加成 反应后极性开环，导致它们发生共价连接。这个共价交联结构扭曲了DNA的双螺旋结构， 阻碍了DNA复制和转录过程，增加了基因突变的风险。 2. 电离辐射引发的DNA断裂 电离辐射是一种高能量辐射，包括α粒子、β粒子和Y射线等，具有足够的能量来与生 物体内的分子相互作用，导致细胞和组织的损伤。DNA分子对电离辐射非常敏感，是电离辐 射作用的主要损伤靶标。由于电离辐射所用粒子能量很高，可以直接作用于DNA分子本身， 破坏其结构，诱导DNA碱基和磷酸二酯键的化学键断裂。此外电离辐射也可以间接诱导各 种形式的DNA损伤，如电离辐射粒子与水分子或氧分子相互作用生成羟基自由基( ·OH) 和活性氧等高度活性的自由基。这些活性自由基可与DNA分子中的碱基、磷酸二酯键等部 位发生反应，导致DNA链的断裂和结构损伤。而活性氧自由基是氧分子中缺失一个或多个 电子的高度活跃的一类分子，它们能够氧化DNA中的碱基，导致核酸的氧化损伤。常见的 氧化损伤包括8-氧-鸟嘌呤(8-oxo-7,8- dihydroguanine, 8-oxo-Gua) 和5-氧化胞嘧啶等。 34 I 第一章 核酸 其中，8-oxo-Gua是 DNA氧化损伤的生物标志物，其在DNA复制时产生G-C 向 T-A 的突 变，具有高度的致突变性。 3.环境化学物质引发的DNA损伤 环境化学物质可以通过直接作用或代谢过程间接作用，引发DNA损伤。最普遍的环境 致癌化学物质可能是烟草产品产生的，如多环芳烃、烟草烟雾中的化学物质等，能够与DNA 发生共价结合，形成DNA加合物。例如，多环芳烃( PAHs) 可通过代谢过程转化为活性代 谢物(如二环芳烯醌)。这些代谢物与DNA结合，形成PAH-DNA加合物，可能引发DNA 损伤，包括DNA 加合物的形成和碱基的修饰。这种结合导致碱基改变，或使DNA链产生结 构性改变，进而诱发各种癌症。 变质的食物也会产生损伤DNA的化学物质，如在霉变的花生中产生的黄曲霉毒素和过 度烹饪肉类导致的杂环胺。其中，黄曲霉毒素( aflatoxin) 是由黄曲霉属真菌产生的一类强 烈致癌的毒素，主要存在于一些食物，特别是容易受到霉菌污染的谷类、坚果和大豆等食品 中。黄曲霉毒素可以和核酸发生多重作用，黄曲霉毒素的代谢活化可与DNA 发生共价结合， 形成DNA加合物。这种结合可以导致DNA链的断裂、碱基修饰等损伤，破坏了DNA的结构和 功能。黄曲霉毒素的代谢产物也具有氧化性，可以直接氧化DNA中的碱基，形成如8-氧-鸟 嘌呤(8-oxo-Gua) 的氧化碱基，进而干扰DNA的正常配对和复制过程。黄曲霉毒素被认为 是肝癌的重要致病因素，其诱导DNA 的损伤和突变可能导致细胞失控增殖和癌症的发生。 烷化剂具有活泼烷基，可以与核酸发生化学反应并将烷基加合到碱基或磷酸上。 常见的烷基化试剂包括硫酸二甲酯( dimethyl sulfate, DMS)、甲磺酸甲酯( methyl methanesulfonate, MMS)、芥子气( mustard gas) 等。其中，芥子气(二氯乙基硫化物， dichlorodiethyl sulfide) 在第一次和第二次世界大战中被用作化学武器，其水解产生盐 酸，对眼睛、呼吸道等产生急性剧烈刺激损伤。此外，更严重的结果是芥子气通过邻位基 团参与发生亲核取代反应，产生活性更高的硫离子，并可以和细胞中的DNA和 RNA 反应 造成长期损伤。碱基中鸟嘌呤的06和N7位点最易烷基化，鸟嘌呤06位点烷基化后与胸 腺嘧啶互补配对，是最可能导致突变的烷基化位点。腺嘌呤N3位点烷基化产生无法配对 的3-甲基腺嘌呤(3mA), 导致DNA聚合酶停顿，复制被阻断。双功能化的烷化剂可引起 核酸碱基间的交联，其可以同时在核酸双链间不同碱基上发生烷基化交联。实验室中常用 的烷化剂包括甲磺酸甲酯( MMS)、甲磺酸乙酯( EMS) 和甲基亚硝基脲( MNU) 等。其中， MMS产生致突变的N7-甲基鸟嘌呤和N3-甲基腺嘌呤，并通过N- 糖苷键的裂解产生AP位 点；而MNU 产生06-甲基鸟嘌呤，与T 错配并诱导G-C向 A-T的突变。烷化剂是一把双 刃剑，其可以作为化学战剂和致病试剂，同时，其也能通过对核酸的烷基化作用靶向肿瘤 细胞中的DNA,从而用于肿瘤治疗，例如氮丙啶( aziridines) 类烷基化试剂(包括氮芥、 环磷酰胺、苯丁酸氮芥和美法仑等)及替莫唑胺( temozolomide,TMZ) 已被用于临床的 抗肿瘤药物。 1.4 核酸的物理和化学性质 |35 1.4.4 DNA 损伤的检测和修复机制 DNA损伤的检测和修复机制是生物体内重要的生物学过程，它确保基因组的完整性 和稳定性。DNA损伤可以由内、外环境因素引起，例如辐射、化学物质、紫外线等，而 细胞通过一系列的检测和修复机制来维护DNA的完整性。当细胞内发生DNA损伤时，共 济失调毛细血管扩张症突变蛋白( ataxia-telangiectasia mutated proteins,ATM) 和共济 失调毛细血管扩张症和Rad3相关蛋白( ataxia-telangiectasia mutated-and Rad3-related proteins, ATR) 等蛋白质会被激活。它们能够感知DNA 断裂、交叉连接和其他损伤，从 而启动细胞内的应激响应。ATM和 ATR 可以通过激活Chk1(checkpoint kinase 1)和Chk2 (checkpoint kinase 2) 激酶来传导信号，对停止细胞周期、调控DNA修复，或在需要时诱 导细胞凋亡具有重要作用。同时，DNA损伤还可以激活关键的抑癌基因p53 蛋白表达。激 活的p53 能够阻滞细胞周期，提供更多时间供细胞内DNA 损伤修复。常见DNA损伤的修 复途径和机制如下。 1.DNA碱基损伤修复 (1)逆转DNA损伤：光修复是一种由光解酶( photolyase)介导的修复机制。在光产 物裂合酶和光裂合酶的作用下，可以修复由紫外线( UV) 辐射引起的光损伤。这种光解酶 能够感知核酸序列中的嘧啶二聚体，并能够改变核酸螺旋结构，使嘧啶二聚体直接与蛋白因 子还原性黄素腺嘌呤二核苷酸相互作用。在光作用下，还原性黄素腺嘌呤二核苷酸将电子传递 给嘧啶二聚体，产生自由基阴离子，从而将嘧啶二聚体解聚成两个嘧啶基团，修复紫外线引起 的嘧啶二聚体类核酸损伤。但这种损伤修复只存在于某些低等生物，人类细胞中不表达DNA 光修复酶，无法实现对光损伤碱基的直接裂解修复。人细胞中存在两种不同的酶，可逆转人 类和哺乳动物的烷基化碱基。其中，06-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(06-alkylguanine- DNA alkyltransferase) 可逆转氧(06)烷基化的DNA损伤，而α-酮戊二酸依赖性双加氧 酶( alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase)可逆转核酸中N- 烷基化碱基加合物。 (2)碱基切除修复( base excision repair,BER ):在紫外线或电离辐射下产生自由基引 起的碱基损伤，可以通过碱基切除修复途径被修复。DNA糖基化酶( DNA glycosylases) 可 以识别并切除损伤部位的碱基，在核酸序列中产生无碱基位点( abasic site)。无碱基的AP (apurinic/apyrimidinic sites) 位点被脱嘌呤嘧啶内切酶( apurinic/apyrimidinic endonuclease, APE) 切除，引起核酸单链断裂( single strand break)。断裂部位的5'端存在的磷酸脱氧核糖 (deoxyribose 5-phosphate,dRP) 会被DNA聚合酶β( DNA polymerase β,Polβ)的裂解活性 (lyase activity)切除，得到少一个碱基的5’磷酸和3'羟基。在DNA聚合酶β作用下引入一 个正常的核苷酸，并通过DNA连接酶LigⅢ与骨架蛋白XRCC1形成复合物，得到正常的双 链DNA,完 成DNA损伤的修复。 不同的核酸损伤需要不同的酶来扫描核酸序列及损伤类型，同时招募相应的酶来修复 核酸，例如，活性氧自由基ROS造成的DNA 损伤通常会在DNA分子中存在8-氧代鸟嘌呤 (8 -oxo-7,8 -dihydroguanine,8-oxo-Gua) 。8-氧代鸟嘌呤DNA 糖苷酶(8- oxoguanine 36 I 第一章 核酸 DNA glycosylase 1, 0GG1) 是一种DNA 修复酶，主要具有DNA 糖基化酶和脱嘌呤/脱嘧啶 (apurinic/apyrimidinic,AP) 裂解酶两种活性，可以感知受损碱基并识别和去除8-氧代 鸟嘌呤。 2. 多重且大面积核苷酸损坏修复 (1)核苷酸切除修复( nucleotide excision repair,NER): 与碱基切除修复相比，核苷酸 切除修复更为复杂，用于处理更广泛和复杂的DNA损伤，例如烷基化或交联剂产生的多重 DNA 损伤。核酸切除修复有转录偶联修复( transcription-coupled NER, TC-NER) 和全基因 组修复( global genome NER,GG-NER) 两种亚途径。在TC-NER中，由RNA聚合酶在转 录过程中识别损伤后暂停转录，然后招募CSB/ERCC6(Cockayne syndrome B) 及下游CSA/ ERCC8复合物等NER修复蛋白来修复损伤，因此TC-NER只在转录过程中发生。而在GG- NER中，体内的蛋白质复合物XPC/RAD23B/CETN2能够感知识别DNA损伤导致的结构畸变 并招募解旋酶TFIIH, 形成XPC-RAD23B-TFIIH复合物。之后，上述复合体再招募内切酶 XPG和XPF/ERCC1,它们会分别在损伤位点的3'和5′侧切割核酸链。当被切下来的片段离 开后，DNA聚合酶和连接酶会在DNA缺失的部分进行补充，从而得到正常的DNA双链，至 此完成整个DNA的修复过程。 (2)错配修复：错配修复主要用于消除核酸复制过程中DNA聚合酶可能产生的单核苷 酸错配，提高复制的保真度，保证基因的稳定性。错配修复途径包括三个步骤：①蛋白质复 合物(如MSH2-MSH6异质二聚体)感知DNA中的错配。②这些蛋白质复合物与DNA分子 结合形成滑动钳，并移动到错配损伤位点，识别需要插入/删除的位置。③由核酸酶将子链 的错配核苷酸切除，并由DNA聚合酶δ填充正确的核苷酸。DNA连接酶再将缺口连接，得 到正确的双链DNA。由于错配修复在维持基因组稳定性方面的重要性，错配修复缺陷无疑会 导致DNA突变增加。 3.DNA 断裂修复 (1)单链断裂修复( single-strand break repair,SSBR): 不同形式的DNA 损伤、细胞 内异常的代谢过程都可能产生DNA单链断裂( SSB)。单链断裂修复可通过碱基切除修复 (base excision repair, BER)、核苷酸切除修复( nucleotide excision repair,NER) 和错配修复 (mismatch repair,MMR) 等途径进行(同本节前两点)。 (2) 双链断裂修复( double-strand break repair,DSBR): 常见的双链断裂修复途径包括 同源重组修复( homologous recombination repair, HRR) 和非同源末端连接( non-homologous end joining,NHEJ) 。HRR 高度依赖姐妹染色单体的存在而更加保守和高保真。这一特性将 同源重组途径限制在细胞周期S/G2期(姐妹染色单体存在的时期)核酸双链断裂的修复， 而NHEJ途径可以在整个细胞周期中修复DNA的双链断裂。 同源重组核酸修复通路包括三个过程：①双链断裂识别( DSBR);②合成依赖链退 火( sequence-dependent strand annealing, SDSA);③ 断裂诱导复制( break-induced replication, BIR)。双链断裂损伤后，损伤位点被激酶ATR和 ATM识别，随后激酶能激 活BRCA1 并可招募核酸外切酶MRE11将两条链损伤附近的一段序列切除。单链在重组酶 1.5 核酸分析技术 |37 RAD51作用下与邻近的其他同源链(一般在姐妹染色单体上)互补，并以同源链为模板 进行DNA 合成。在合成到原本的双链能够部分互补后，这条单链从同源链上脱离并结合 到原本与其互补的另一条链上，并以其作为模板通过DNA聚合酶进行DNA 合成。在完成 DNA 合成后，由DNA连接酶生成磷酸二酯键从而得到无损的DNA双链，完成对DNA双链 断裂的修复。 非同源末端连接是DNA 双链断裂损伤的另一重要修复机制。与 HRR 相反，NHEJ不需 要同源片段。自身免疫抗原Ku70/Ku80与双链断裂损伤部位结合，招募DNA Pkcs(DNA 依 赖性蛋白激酶催化亚基)形成激酶复合物，进而再招募并磷酸化激活核酸酶。活化的核酸 酶将相邻损伤片段切除，再由DNA 聚合酶及连接酶直接连接末端。NHEJ机制容易引发染 色体重排、序列的丢失及移位，继而导致基因的突变。 微同源介导的末端连接( microhomology-mediated end joining , MMEJ) 相当于NHEJ 的替代方式，在NHEJ未激活时细胞用这种方式修复DNA双链断裂损伤。NHEJ过程中所需 的蛋白质Ku70-Ku80及Rad1可以抑制MMEJ路径。当这些蛋白质不再与DNA 损伤部位结 合时，相应的替补MMEJ路径被激活，此时MRX复合物、Sae2及Exo1通过核酸酶作用从5' 端至3'端切除损伤部分的核酸序列，继而暴露出微同源序列。双链上的微同源序列互相结 合，随后经过剪切修饰及连接得到无损的DNA 双链。这种情况下得到的DNA 双链相比于原 来的双链，缺失了微同源序列5'端被核酸酶剪掉的那段核酸序列。在微同源序列之间结合 不够稳定的情况下，DNA 聚合酶还可以将3'端的互补序列随机延伸。如果新得到的序列能 与原微同源序列稳定结合，那么二者结合后就通过同样的剪切修饰和连接得到无损的DNA 双链。然而在这种情况下得到的DNA双链与原双链相比，缺少了一开始被核酸酶切掉的那 部分，同时插入了TLS聚合酶延伸的那部分序列。因此，MMEJ这种双链断裂修复方式是 极易发生突变的。 |1.5 核酸分析技术 1.5.1 核酸定量分析 1. 核酸的荧光染色和定量分析 高灵敏度的核酸检测和定量分析通常依赖于荧光染色或标记。序列非特异性的核酸分 析一般采用能够与核酸结合的荧光染料分子，包括溴化乙锭、SYBR Green I 、Gel Red等。 溴化乙锭( ethidium bromide,EB) 含有一个可以嵌入 DNA堆积碱基间的三环平面基团 (图1.41),在水溶液中的背景荧光很弱。EB通过嵌插作用插入两个碱基对之间后，DNA 内部的疏水环境在一定程度上保护了其共轭芳环，使其荧光强度显著增强。EB与 DNA 的结合几乎没有碱基序列特异性，在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入 一个溴化乙锭分子，因此样品荧光信号的总强度与双链DNA的总量正相关，可以用于双 链DNA的定量分析。由于EB的强致癌性，其逐渐被SYBR系列染料替代。SYBR Green I ( 图1.42)结合于DNA小沟区域，常应用于qPCR 。SYBR GreenⅡ则适合对RNA和单 链DNA染色。SYBR Gold则既可用于DNA染色也可用于RNA染色，且灵敏度比SYBR Green的更高。 图1.41 EB 结构及其与DNA的结合。 图1.42 SYBR Green I结构。 序列特异性的核酸定量分析通常利用一类能够与待测核酸进行特异性杂交的分子探针， 也称为分子信标( molecular beacon, MB), 具体原理参见1.4.1。 2. 聚合酶链式反应技术 (1)聚合酶链式反应：聚合酶链式反应( polymerase chain reaction, PCR) 是一种体外扩 增特异DNA片段的技术，具有快速、简便、灵敏度高的特点。其主要通过变性、退火、延 伸三个基本反应步骤扩增DNA: 通过加热变性解开双链DNA; 降温使引物分别与两条解开 的单链退火；升温到耐热性DNA聚合酶最适宜温度，启动链延伸反应。如此三步反应往复 循环，达到扩增目标DNA 区域的目的(图1.43)。 (2)逆转录PCR: 逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR) 联合了RNA逆转 录反应和PCR反应。该技术首先在逆转录酶作用下，将已有的RNA逆转录成cDNA, 之 后 图1.43 聚合酶链式反应。 1.5 核酸分析技术 |39 以cDNA 为模板扩增得到目的片段。RT-PCR可以用一步法或两步法的形式进行：两步法中 逆转录和PCR各自在最优化条件下进行，通常取逆转录产物的1/10进行第二步反应，适合 多基因的RT-PCR; 一步法中逆转录和PCR同时进行，逆转录和PCR都不能在最佳条件下 进行并且容易相互干扰，但操作简便、可以减少污染，并且由于得到的全部cDNA产物都会 进行PCR 扩增，使得一步法的灵敏度更高。 (3)实时荧光定量PCR: 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR) 是在常规PCR 的基础上加入相应的 荧光标记探针或染料，通过收集荧光信号实时监测PCR进 程，以实现对起始模板的定量分析。在PCR反应中，产物累 积伴随荧光信号等比例增长。每完成一个循环，系统记录一 个荧光强度数据点，以此实时追踪荧光强度动态变化，监测 产物数量增减趋势，绘制出直观的荧光扩增曲线图。PCR产 物的荧光曲线可分为四个阶段(图1.44)——基线期、指数 增长期、线性增长期、平台期。模板的C 值是指反应管内的 荧光信号到达预先设置的荧光阈值时的循环数。在PCR的指 数增长期，它和该模板起始拷贝数的对数有线性关系，所以 成为定量的依据。荧光阈值是在qPCR 反应过程中，用于区 分背景信号和真正的扩增信号的一个临界值。它通常设定在荧光扩增曲线的指数增长阶 段。荧光阈值一般设定为背景荧光信号标准偏差的10倍左右，或是PCR 扩增信号进入 相对稳定指数增长期时的荧光值。起始模板量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即CT 值越小。 实时荧光定量PCR的分析方法主要有两种：①绝对定量，又称为拷贝数，用于测定未 知样本中某核酸序列的绝对量；②相对定量，用于分析测试样本中目标序列与参比样本中同 一核酸序列的相对量。 常用的荧光定量PCR检测方法可分为非特异性荧光标记法和特异性荧光标记法。非特 异性荧光标记法常用SYBR Green I对DNA染色。SYBR Green I结合到DNA双链发出荧光信 号。而那些未能掺入DNA 双链中的染料分子则几乎不产生荧光信号。这一特性确保荧光信 号的增强与PCR产物的生成量之间呈现完美的同步性(图1.45)。由于染料分子也能和非特 异性扩增的DNA产物结合并发出荧光，所以需在实验结束时做熔解曲线分析，只有当曲线 呈现单一峰时，才可以认为定量是准确的。 特异性荧光标记法常采用TaqMan探针法(图1.46)。TaqMan探针是一段能与目标DNA 结合的特异性DNA片段，报告基团R 标记于5'端，猝灭基团Q 标记于3'端，作为完整探针 存在时，报告基团R的荧光被猝灭基团Q 所吸收，无荧光；退火时，荧光探针和引物与模板 互补链配对；延伸时，探针被Taq DNA 聚合酶的5'-3'外切酶活性酶切降解，基团R 和Q分 离，产生荧光信号。每扩增一条DNA链，就会形成一个新的荧光分子，从而使荧光信号的 累积与PCR产物的增加完全同步。 初始DNA 模板——浓度太低检测不到荧光 延伸 图1.45 SYBR Green法原理。 图1.46 TaqMan探针法原理。 等温核酸扩增技术是一种在恒定温度下进行核酸扩增的技术，具有简便、扩增效率 高、小型化、自动化等突出优势，是便携式分子诊断发展的理想候选技术，目前已有多种 方法被开发出来，例如环介导等温扩增技术、滚环扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术、链 置换扩增技术、依赖核酸序列型扩增技术、单引物等温扩增技术、交叉引物等温扩增技术 等，下面选取常用的滚环扩增技术进行简单介绍。 滚环扩增技术( rolling circle amplification, RCA) 是沿环状单链DNA模板，在DNA 聚合酶的存在作用下，进行连续的滚动式复制的等温扩增技术。滚环扩增可分为线性扩增、 指数扩增、多引物扩增多种方式(图1.47)。线性RCA是在DNA聚合酶作用下，引物与环 状DNA 底物结合后进行延伸，产生一条含有多个重复序列的长链DNA产物。指数RCA 是在 线性RCA的基础上，加入一条反向引物，这条引物能够与线性RCA产物结合并酶促延伸，形 成多分支扩增反应。每一轮反应都会产生更多的新的扩增产物，使得扩增反应呈指数增长。 1.5 核酸分析技术 141 (a) 线性RCA 图1.47 RCA原理。 1.5.2 核酸杂交分析 互补的核苷酸序列通过Watson-Crick 碱基配对形成非共价键，从而形成稳定的同源(双 链DNA、双链RNA) 或异源( DNA/RNA杂合链)双链分子的过程，称为核酸杂交。采用核 酸杂交技术，能够实现对靶核酸序列的定性和定量分析。 1.DNA和RNA印迹法 DNA印迹法( Southern blotting)由英国科学家Edwin Mellor Southern 于1975年提出，是 分子生物学中应用最广泛的DNA检测方法之一。DNA印迹法的基本原理是利用标记(³P 同 位素标记、荧光基团标记等)的DNA探针分子与靶标 DNA分子杂交，实现对靶标DNA分 子的标记与检测。其一般过程是先将待测DNA样本经过限制性内切酶消化并进行凝胶电泳 分离，然后变性处理，将单链DNA片段原位转移到硝酸纤维素膜、尼龙膜或其他固相支持 物上，固定后用带标记的DNA探针分子在相对严格的环境下进行杂交，经洗涤后对标记信 号进行检测(图1.48)。由于杂交具有高灵敏性和特异性，故DNA印迹法常用于检测样品中 的DNA及其含量、基因同源性分析、重组DNA检测、靶DNA分子的序列长度等。 RNA印迹法( Northern blotting) 是利用标记的核酸探针分子与靶标RNA分子杂交，实 现对靶标RNA的定性和定量分析，其流程与DNA印迹法类似，故不再详细描述。 2.DNA 微阵列技术 DNA 微阵列技术( DNA microarrays), 有时也称DNA芯片技术( DNA chips),其原理是 在一块1cm² 大小的固相支持物(特殊玻璃片、硅圆晶片等)上，有序地、高密度地(点间 距小于500 μm) 排列固定大量(数千或数万)核酸探针，然后将其与待检测的核酸样品进行 杂交，借由荧光等方式检测，即可提供大量的待测样本的序列、浓度等相关信息。 DNA微阵列技术的种类多种多样，根据制作方式可以分为以下几种：①Stanford型，将预 先合成好的核酸探针布放于芯片载体上制得，根据布放方式又可分为点制法和印制法；②原 位合成型，在芯片上原位合成核酸探针分子，生成精准(定位准确且位向均一)、超高密度 ③ 核酸的印记与迁移 样品 DNA/RNA 凝胶电泳 图1.48 DNA/RNA印迹法流程。 (1×10⁶~2×10⁶点)的核酸探针微阵列；③微珠布放型，将核酸探针制作于独特的微珠上， 再将其布放于特制芯片上制得。 自20世纪80年代开始，科学家们陆续发现在真核生物基因组中广泛存在着一系 列高度串联重复序列，如 α-珠蛋白基因的侧翼序列( flanking sequence )、肌红蛋白 基因的第一个内含子区域等，这些序列根据重复单元核苷酸的长度可以分为卫星DNA (satellite DNA,重复单元的长度超过100 bp), 小卫星DNA(minisatellit e DNA, 重 复单元的长度为7~100 bp); 微卫星DNA(microsatellite DNA, 重复单元的长度为 2~6 bp)。这些高度串联重复序列的重复单元具有保守性，但重复次数有个体差异性， 因此DNA 长度具有个体特征。 1985年，英国遗传学家Alec J.Jeffreys用串联重复序列作为探针，以DNA印迹技术 为基础，开发出DNA 指纹图谱技术( DNA fingerprint) 。 其原理为用限制性内切酶消化 个体的染色体DNA,再以串联重复序列作为探针对得到的不同长度片段进行DNA 印迹， 最后得到的带型图谱对每个个体而言都是独一无二的(同卵双胎例外),并且还具有简 单而稳定的遗传性，故在亲子鉴定、法证科学、谱系鉴证和辨别濒危物种等领域均有广 泛应用。 荧光原位杂交技术( fluorescence in situ hybridization, FISH) 利用荧光标记的单 链核酸探针分子与染色体或DNA 纤维切片上的靶DNA杂交，之后通过荧光成像，即可直接 观察靶DNA所在的原始位置。 荧光原位杂交技术相较于其他杂交技术，有几个突出的优点：①不需要放射性同位 素标记，更加经济安全；②荧光探针稳定性高、特异性好；③可通过多次杂交提高灵敏 1.6 核酸的合成与修饰 143 度，分辨率高；④可以多重染色。这些优点使得其在染色体精细结构变异分析、人类产 前诊断(唐氏综合征、18-三体综合征的检测等)、肿瘤靶向治疗和辅助检测、动植物基因 组结构研究、环境菌样分析等许多领域都有应用。 |1.6 核酸的合成与修饰 1.6.1 寡核苷酸的化学合成与修饰 寡核苷酸( oligonucleotides)是由较短的核苷酸单元组成的核酸链，通常由几个到几十 个核苷酸组成。寡核苷酸的化学合成与修饰是分子生物学和医学研究中常用的技术手段之 一。不同长度的寡核苷酸在生物、化学、基因工程等领域均有广泛的应用。长度在20~30个 核苷酸的寡核苷酸通常被用作引物、探针或小干扰RNA(siRNA) 等分子生物学实验中的工 具。为提高寡核苷酸的稳定性，对特定序列的寡核苷酸进行化学修饰可进一步增强其稳定 性、亲和性等性质。反义核酸、siRNA等可以和靶基因相互作用调控靶基因的表达水平，已 经用于疾病的临床研究和治疗。 1. 寡核苷酸化学合成的发展 寡核苷酸化学合成是指用有机化学方法合成较短片段的DNA或RNA的技术(图1.49)。 早在1955年，英国剑桥大学的Michelson和Todd第一次通过化学方法将两个脱氧胸腺嘧啶 核苷酸连接在一起。他们使用了H- 膦酸酯和磷酸三酯法使两个活化的核苷酸单元之间发 二核苷酸合成 寡聚核苷酸固相合成 图1.49 寡核苷酸合成方法的发展历程。 44 I 第一章 核酸 生缩合反应，通过亲核反应使两个核苷酸间形成磷酸二酯键，得到二核苷酸。Rammler和 Khorana等人在20世纪60年代初引入了一种新的可以合成长链寡核苷酸的磷酸二酯法。其 基本原理是将一个5′端带有适当保护基的脱氧单核苷酸，与另一个3'端带有适当保护基的 脱氧单核苷酸进行偶联，化学合成含磷酸二酯键的脱氧二核苷酸分子。1970年，Khorana同 样使用磷酸二酯法首次合成了丙氨酸的tRNA序列。然而上述磷酸二酯法需要在每一步进行 额外的纯化步骤，使得合成较长的寡核苷酸是不切实际的。六七十年代，Letsinger通过磷 酸三酯固相合成法解决了磷酸二酯法的缺陷。磷酸三酯固相合成法合成足够简单，可以快 速复制，并据此原理开发出第一台寡核苷酸合成仪。80年代，Marvin Caruthers开创了寡核 苷酸的亚磷酰胺合成法，并利用自动化的固相技术成功合成寡核苷酸，也是目前应用最广 泛的寡核苷酸合成技术。该方法不仅可以合成指定序列的DNA 或 RNA, 更可根据需要掺 入人工修饰的核苷酸。亚磷酰胺固相合成法自问世以来，推动了核酸生物化学和化学生物 学的快速发展。 2. 寡核苷酸化学合成法 寡核苷酸合成的关键是高效构建连接核苷的磷酸二酯键。通过化学合成法已经可以合成 长达200个碱基的寡脱氧核糖核苷酸和100多个碱基的寡聚核糖核苷酸。目前已知的寡核苷 酸合成法包括Khorana DNA磷酸三酯化学合成法、Letsinger DNA亚膦化学合成法、Caruthers DNA 亚磷酰胺固相合成法。目前的寡核苷酸主要是通过Caruthers DNA亚磷酰胺固相合成法 合成的。 知识盒子：DNA 化学合成法 Khorana DNA化学合成法：化学家H.Gobind Khorana 通过核苷的3'-羟基直接与5'活 化的磷酸基团和3′羟基乙酰基保护的核苷发生取代反应构建磷酸二酯键。每一步偶联反应 后，使用氢氧化钠将保护基团乙酸酯脱去并水解形成磷酸二酯键。释放出来的3'-羟基可 以用于下一步偶联反应。Khorana的开创性寡核苷酸合成方法合成了可在蛋白质合成中用 作模板的寡核苷酸，使得遗传密码破解工作得以顺利完成。此磷酸酯键的合成方法与聚合 酶催化的酶促反应类似。但该方法受制于3'仲羟基的位阻效应，每步亲核偶联反应的产率 不超过80%,合成10个碱基的寡聚核苷酸产率仅仅10%左右，而且寡核苷酸链长增加溶解 度下降，每一步的纯化难度急剧增加。 Letsinger DNA亚膦化学合成法：Robert L. Letsinger在DNA合成领域作出了重要 的贡献，特别是开发了亚膦化学，极大地推动了寡核苷酸的合成。相比于前期发展的磷 酸酯合成法，质子化的亚磷酸酯比质子化的磷酸酯具有更少的氧取代基，相应的亚磷酸 酯具有更小的位阻和更强的亲电性。同时，亚磷酸酯通过其质子化磷翁中间体，反应速 率比磷酸酯快达10¹²倍，可实现更快更高效的核苷酸偶联，奠定了现代 DNA合成技术的 基础。 Caruthers DNA亚磷酰胺固相合成法：Caruthers DNA亚磷酰胺固相合成法是由美国化 学家Marvin H.Caruthers于20世纪80年代初提出的一种合成DNA的方法。DNA亚磷酰 胺固相合成法是Caruthers对核酸合成领域作出的重要贡献之一。他将Letsinger 发展的 亚磷酸酯化学应用到固相载体上，可以简单快速洗脱掉反应试剂，简化核酸纯化过程。此 外，Caruthers还在Letsinger 的亚磷酸酯化学的基础上，开发了更稳定的亚磷酰胺单体， 1.6 核酸的合成与修饰 145 并将亚磷酰胺化学应用于DNA的固相化学合成。亚磷酰胺单体模块和自动化固相合成技术 已成为目前寡核苷酸合成最常用的方法。 3. 寡核苷酸的固相合成 寡核苷酸的化学合成是生物医学研究中常用的技术手段，用于合成具有特定序列的短链 寡核苷酸。在化学合成中，主要采用的方法是固相合成。 固相合成的基本原理：固相合成是一种在支持物质上逐步建立核苷酸链的方法。支持 物通常是一个经过功能化的固体颗粒，上面已经连接有一个核苷酸或者是一个通用可剪切基 团。在固相合成中，寡核苷酸合成是从3'端向5'端逐步构建的。合成通常从一个固定在固 相载体上的核苷酸单元开始，然后通过连续的化学反应，每一步都在上一步的基础上添加一 个新的核苷酸单元。合成过程中，反应的端基团被保护，以确保特定的化学反应只在目标位 置发生。重复合成循环，直至序列中的每一个核苷酸单元均按顺序完成偶联，从而成功合成 出完整的寡核苷酸链。 固相合成的基质载体：可控孔径玻璃( controlled pore glass,CPG )是最经典、应用最广 的寡核苷酸固相合成基质。CPG固相通常由控制孔径和孔隙结构的玻璃制成，具有大量微小 的孔隙，提供了大表面积用于反应。同时固相表面带有特殊的功能基团，可通过酯键与亚磷 酰胺单体3'端羟基或可断裂的通用载体形成酯键。但合成寡核苷酸的长度受到CPG载体的 孔径、装载量、修饰基团等多种因素影响，人们常在CPG上引入多种修饰(如长PEG连接 臂、长烷基链的连接臂等),以达到增加中间体分散性和稳定性、减少杂质、降低试剂消耗， 提高寡核苷酸合成的长度等。 CPG载体的孔径一般在50~1000 A不等，可根据合成序列的长度选择不同孔径的CPG 载体。CPG孔径的选择基于寡核苷酸的长度、复杂性和应用，对于在整个合成循环中保持 高偶联效率至关重要。通常选择孔径500 A 和1000A的 CPG用于DNA合成。一般孔径为 500 A的 CPG固相可用于合成链长小于60nt 的寡核苷酸。当寡核苷酸链长度增加时，选 择500 A的孔径难以更好地容纳和分散长链寡核苷酸，合成效率会下降，需要增加CPG的 孔径。核酸链长度大于60 nt 时，通常使用1000 A的 CPG来提高偶联效率，满足合成长达 175 nt 的寡核苷酸的条件。 在固相合成时，通常将CPG填料预装在DNA合成柱或合成板内。第一代合成柱中CPG 填料没有固定，装配简单，可操作性强，合成量大。在此基础上经过不断优化，将通用合成 柱的CPG填料与超高分子量聚乙烯或高密度聚乙烯烧结，得到更加高效、快速和经济的第二 代合成柱。第二代寡核苷酸合成柱具有更高的合成效率和更低的错误率，可获得更高纯度的 寡核苷酸，同时能够减少合成试剂量，提高合成速度，节省合成时间和降低总体合成成本， 且更加环保。此外，为了更高通量地合成寡核苷酸，可以通过CPG结合小型滤器烧结技术和 通用连接子( universal linker)技术，将CPG粉末嵌入熔块中，固定了溶剂的流动路径，制 备寡核苷酸合成板。合成板高度和直径经优化后，能够减少反应物浪费和清洗剂的消耗，提 高了合成效率，降低了成本。合成膜以超高纯度UHMW-PE作为基材烧结而成，具有强的疏 46 I 第一章 核酸 水性，为对水敏感的亚磷酰胺单体营造了理想的无水环境。合成板的出现为高通量的固相合 成提供了方便快捷、高效率的合成环境。目前常见的有96孔合成板、768孔合成板，可以更 好地适配192通道及768通道的合成仪。 固相合成的亚磷酰胺单体：亚磷酰胺单体( phosphoramidite)是目前应用最广泛的寡 核苷酸合成单体，作为寡核苷酸的合成模块，根据特定核酸序列依次耦合到固相载体上。 亚磷酰胺单体包含一个不同碱基保护修饰的核苷(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶/ 尿嘧啶，以及各种修饰碱基等)及一个含亚磷的化学基团。胸腺嘧啶和尿嘧啶因为碱基上 没有活性基团通常不需要保护，但腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶的碱基上均有伯胺基团，需 要额外的功能基团保护。常用的保护基团包括乙酰基( Ac) 、苯甲酰基( Bz)、异丁酰基 ( iBu)、异丙基苯氧基乙酰基( iPrPAC) 及N,N- 二甲基甲酰胺( DMF) 等。根据序列及 脱保护的条件可以对各个碱基氨基采用不同的保护基团。为了能够实现寡核苷酸的自动化 和模块化合成，核苷的戊糖或脱氧戊糖的5’位羟基采用4,4'-二甲氧基三苯甲基( DMTr) 基 团保护。在固相合成的每一步完成后可通过酸性条件下的脱DMTr过程来释放5’位羟基，用 于下一个核苷酸的耦合。而3'位的羟基与2-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺或双(二异 丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦反应得到相应核苷的亚磷酰胺单体。对于RNA结构中的戊糖 2'位羟基，则需要在单体合成过程中利用叔丁基二甲基氯硅烷( TBDMS) 或者三甲基硅甲 基醚( TOM) 的硅醚化合物来保护。在完成寡核苷酸合成及脱保护后，可以在氟离子作用 下脱除。 4. 寡核苷酸的固相合成过程 目前大多数商业化DNA合成仪所使用的底层技术是亚磷酰胺三酯合成法(图1.50),根 据合成通量，可以采用合成柱和合成板来合成。此方法具有高效、快速偶联等优点，在DNA 化学合成中广泛使用。 不同于酶促的5'→3'方向的DNA延伸合成过程，DNA化学合成是由3′端开始的。先 将酸活化的核苷亚磷酰胺分子耦合到一个固定在固相的脱氧核苷酸分子上。其中，经常采用 的固定化表面主要是可控孔径玻璃( CPG)。各种核酸合成试剂按程序自动被泵入系统并流经 CPG载体，按照序列依次分步将核苷亚磷酰胺单体加入寡核苷酸CPG固相上，使寡核苷酸 链不断延长。寡核苷酸化学合成具体反应步骤如下(图1.50): (1)脱保护基团(deblocking): 用三氯乙酸( TCA) 二氯甲烷溶液(三氯乙酸的终浓 度为3%)泵入CPG固相，脱去连接在CPG 上的核苷5′位羟基或通用固相载体上羟基的保 护基团(4,4'-二甲氧基三苯甲基，DMTr), 得到游离的5'-羟基端或者通用固相上的游离 羟基。脱保护反应完成后，使用乙腈洗涤去除残留的脱保护剂，以防止脱保护剂残留影响 下一步反应。 (2)活化( activation): 将亚磷酰胺保护的核苷单体与四氮唑活化剂同时泵入CPG固相 并原位活化亚磷酰胺单体。四氮唑将3'端磷酸基团位置上的二异丙氨基质子化，形成亚磷酰 胺四唑活性中间体。 (3)偶联( coupling): 上述亚磷酰胺四唑活性中间体与CPG上核苷的游离5'-羟基发生 亲核反应形成新的磷氧键，同时脱去活性中间体的四氮唑。反应完成后，使用乙腈洗涤CPG 固相。此时CPG载体上寡核苷酸延长一个核苷。 (4)加帽(capping): 为了避免上一步亚磷酰胺单体耦合不够彻底，防止CPG上未参与 1.6 核酸的合成与修饰 I 47 图1.50 亚磷酰胺三酯法合成循环示意图。 反应的核苷游离的5'端羟基参与下一个循环反应，产生短链杂质，在开启下一个偶联循环 前，需要对5'端游离羟基进行封闭。通常采用乙酰化试剂(如乙酸酐和N-甲基咪唑混合物) 加帽来封闭游离的5'端羟基。加帽反应完成后，使用乙腈洗涤CPG固相。 (5)氧化(oxidation): 耦合中核苷亚磷酰胺单体通过亚磷酰胺与CPG上的寡核苷酸的 5′端羟基反应形成亚磷酸酯，而三价的亚磷酸酯通常不稳定且易被酸或碱水解。因此，通常 采用碘的四氢呋喃溶液(含有吡啶和水的混合溶液)在加帽后将三价的亚磷酸酯氧化为五价 的磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。氧化结束后，继续进行下一轮循环，直至链延伸至所需 的长度。 DNA/RNA合成仪是完成上述一系列化学合成过程，实现寡核苷酸合成自动化，精准可 控的设备。当输入需要合成的碱基序列后，合成仪根据序列按照既定程序自动完成寡核苷酸 的合成(图1.51)。 去三苯甲基化 (Detritylation): 通过三氯乙酸(TCA)处理 脱去5'-0-DMTr,释放5'-OH 进行下一步磷酸化 开始： CPG键合的 核苷酸 5~6min/循环 循环从2到n 循环结束 活化/加成 (Activation/Coupling): 将四唑和亚磷酰胺的混 合物加入反应室，形成一个与 5'-OH快速反应的活性物质 封端(capping): 乙酸酐和DMAP形成酰 基毗啶铺中间体，可封闭在 上一步没有反应的5'-OH 氧化(Oxidation): 不稳定的亚磷酸酯键被 氧化成DNA中稳定的磷酸酯 键 脱保护/切割 (Deprotection/cleavage): 键合完成后，除去氰乙 基保护基和碱基上的保护基 团，产物链从固体载体上切 割下来 CPG键合的寡核苷酸 图1.51 寡核苷酸的自动化固相合成。 1.6.2 寡核苷酸的化学修饰技术和应用 寡核苷酸的化学修饰是对寡核苷酸的碱基、戊糖环和磷酸二酯进行特定功能化的修 饰，以增强和拓展其在生物医学等领域的科学研究和应用。这些修饰可以改善寡核苷酸的 稳定性、亲和性、药代动力学等特性。目前常见的寡核苷酸包括反义寡核苷酸( antisense oligonucleotide,ASO) 、siRNA(small interfering RNA)、microRNA、基因编辑向导RNA (gRNA), 以及核酸适配体( aptamer) 等 。ASO, siRNA 和microRNA通过碱基互补配对与靶 基因mRNA 或pre-mRNA杂交，理论上可以选择性地调控任何靶基因和靶蛋白的表达，包括 许多“不可成药”的靶蛋白。核酸适配体可以通过其独特的三级结构而不是其序列与靶蛋白 结合。与传统的小分子药物相比，利用寡核苷酸作为药物是一种全新的治疗方法。然而，天 然的寡核苷酸由于其稳定性差且易降解，难以直接成药。对寡核苷酸的化学修饰成为提高其 成药性的关键。最近几年获得美国FDA批准的Givosiran,Lumasiran和Viltolarsen等寡核苷 酸药物均在碱基、糖环和磷酸骨架，以及寡核苷酸末端进行了系列化学修饰。 1.6 核酸的合成与修饰 I 49 寡核苷酸的常见化学修饰有以下三种类型。 1. 核苷修饰 目前对于寡核苷酸中核苷的修饰可以在碱基和糖环等处引入不同功能基团，以改变 其性质或功能。常见的碱基修饰包括5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine) 、5-羟甲基胞嘧啶 (5-hydroxymethylcytosine)、N6-甲基腺嘌呤( N6-methyladenine) 和假尿嘧啶( pseudouridine, 重) 等。这类修饰本身在生物学中具有重要的意义，可以调控基因表达、蛋白质合成等生物过程。 核酸药物引入这类修饰还可以增加核酸药物的稳定性和降低其免疫原性。 针对核苷糖环的修饰是目前最主要的核苷修饰方式，包括戊糖环2’位取代，锁核苷修 饰，开环核苷修饰及六元环核苷类似物等。其中最简单的糖环修饰方式可以在戊糖的2′位引 入甲氧基，或者用氟原子、甲基乙氧基等不同功能基团取代。而锁核苷的修饰可以从不同位 置在戊糖环的基础上引入新的环状结构来锁定戊糖的构象，从而在不影响修饰寡核苷酸的碱 基配对的同时，提高寡核苷酸与配对序列的结合力和稳定性。将五元戊糖结构改成六元环， 如利用吗啡啉环代替戊糖的吗啡啉寡核苷酸( eteplirsen) 目前已经用于临床杜氏肌营养不良 (DMD)的疾病治疗。 2. 磷酸骨架修饰 寡核苷酸磷酸骨架修饰是指在DNA或RNA分子的磷酸骨架上引入一些化学修饰，以 改变其电荷状态、稳定性或参与特定的生物学功能。天然核酸的磷酸二酯键(特别是单链 状态时)对核酸水解酶不稳定，可以被核酸内切酶和核酸外切酶水解。未修饰且无特殊结构 的单链寡核苷酸在细胞内的半衰期为30min左右。因此，寡核苷酸需要经过修饰才能得到更 广泛的应用。针对寡核苷酸磷酸骨架修饰的类型比较有限，而且部分修饰可能降低或丧失其 原有的生物学功能。目前报道的磷酸骨架修饰包括磷酸骨架硫代修饰(磷酸硫酯)、氨基取 代、甲基取代、硼烷取代、炔基取代及磷酰胺取代等，其中硫代修饰是目前最广泛采用的 磷酸骨架修饰方式。硫代修饰的DNA寡核苷酸可以显著提高其对核酸水解酶的抗水解能力， 同时仍然保留其RNase H的识别和降解目标RNA的活性，在反义核酸药物(如Fomivirsen, Inotersen,Mipomersen, Nusinersen)中广泛采用。其他的磷酸骨架修饰通常提高了寡核苷 酸的疏水性，增强了其与靶标序列的亲和力，但是所有修饰的寡核苷酸均丧失了其原有的 RNase H的识别和降解目标RNA的活性。 3. 末端修饰 寡核苷酸的端基修饰是在核酸探针、核酸检测及核酸药物研究中最广泛采用的修饰类 型。目前利用修饰基团的亚磷酰胺单体和CPG固相可以非常方便地在寡核苷酸的5′和3'端基 进行荧光基团、氨基、巯基、炔基、生物素及不同长度的聚乙二醇( PEG) 和烷基链等多种类 型的修饰。荧光基团修饰的寡核苷酸常用于核酸检测及功能核酸递送过程中的靶向定位研究。 而氨基、巯基、炔基等具有反应活性的基团可以实现对寡核苷酸的进一步功能化修饰。核酸药 物哌加他尼( Pegaptanib)具有端基PEG修饰，该修饰可以增强核酸药物的稳定性及组织滞留 时间。同样，近年来获批的多个siRNA药物(如 Givosiran,Lumasiran,Inclisiran,Casimersen, Vutrisiran等)均在其正义链3'末端修饰有三齿的GalNAc基团。GalNAc基团具有肝的组织靶 向性，可以实现siRNA对肝细胞的靶向递送，以及肝相关疾病的核酸药物治疗。 1.6.3 寡核苷酸的生物合成与修饰 寡核苷酸的化学合成和生物合成各具优势。化学合成的寡核苷酸受限于固相合成耦合效 率，通常不超过200个碱基，但寡核苷酸的生物合成可以利用模板在聚合酶的作用下进行扩 增，可以制备成百上千个碱基的寡核苷酸，但通常聚合酶可以兼容的修饰核苷酸非常有限。寡 核苷酸的生物合成包括DNA和RNA寡核苷酸的合成，这一过程可以在细胞内或体外进行。 1.DNA寡核苷酸的生物合成 DNA链的生长是由DNA聚合酶催化的，该酶能够识别DNA模板链上的碱基并与之互补 配对。在DNA生物合成过程中，4个脱氧核苷三磷酸[包括脱氧腺苷酸( dATP)、脱氧胸腺 苷酸( dTTP)、脱氧鸟苷酸( dGTP) 和脱氧胞嘧啶酸( dCTP)] 根据模板链上序列将互补碱 基核苷酸在DNA聚合酶的作用下连接到新合成的DNA链上。由于DNA聚合酶能在引物链 的3'端沿5′→3'方向延伸合成新链，两个相对的DNA 链可在聚合酶催化下同时合成。 DNA的寡核苷酸生物合成通常用于构建质粒的核酸序列片段的扩增，以及反转录和定量 PCR的基因转录水平的定量分析。在评估基因敲降的水平时，通常需要利用反转录试剂盒， 以RNA为模板将RNA的序列信息逆转录成相应的DNA。再利用DNA聚合酶和两个DNA寡 核苷酸引物，对逆转录出的靶标DNA进行实时定量扩增，从而反推出靶基因的RNA水平。 同时，利用逆转录出的目标DNA, 可以对目标DNA进行扩增并插入质粒表达系统，从而构 建特定靶基因的质粒，用于基因生物学功能和体外蛋白表达等相关研究。 2.RNA 寡核苷酸的生物合成 RNA合成的启动由RNA聚合酶识别并结合到DNA模板链的启动点，在RNA聚合酶的 作用下，读取模板DNA链上的碱基并将与之互补配对的核苷三磷酸[腺苷酸( ATP)、尿苷酸 (UTP)、鸟苷酸( GTP) 和胞苷酸( CTP)] 依次偶联到新生RNA上，形成与模板配对的新生RNA 链。与DNA生物合成不同，RNA链的合成通常只涉及DNA模板的其中一条单链。而新生RNA链 的终止是由RNA聚合酶识别终止核酸序列而触发的。体外转录法合成小干扰RNA(siRNA)有 效片段是RNAi基因功能快速筛选的有效方法。以双链DNA寡核苷酸序列作为生成siRNA的模 板，利用T7启动子在体外介导T7 RNA 聚合酶的转录，可生成对应的siRNA正义链或反义链。 生成的siRNA是与体内活性相同形式的5'端磷酸化siRNA。此外，新型冠状病毒的mRNA疫苗 利用表达病毒的Spike蛋白片段的DNA质粒在RNA聚合酶的作用下合成相应的RNA, 并经脂 质纳米载体( LNP) 递送到细胞中表达相应的抗原片段，激活机体的免疫功能。 1.6.4 寡核苷酸的生物修饰和应用 生物修饰是指通过在寡核苷酸分子上引入特定的化学结构或功能基团，改变其性质和活 性的过程。这些生物修饰可以增强寡核苷酸的稳定性、亲和性、生物分布和药效学特性.从 而拓展其在生物医学研究和治疗中的应用。 聚合酶可以特异性地识别天然核苷酸，并根据模板序列在新生核酸中引入配对的碱基。 除了某些特殊的修饰核苷酸(如5-乙烯基尿嘧啶、5-炔基尿嘧啶，以及在原有核苷酸基础上 用于标记的修饰核苷酸等),大部分人工合成的非天然碱基有可能难以被DNA/RNA聚合酶识 1.6 核酸的合成与修饰 151 别或者不能维持聚合酶的高保真度。利用分子生物学和蛋白质工程领域中聚合酶的定向进化 技术，在天然聚合酶的基础上随机或有目的地引入突变，创建具有多样性的基因库，随后将 这些突变的聚合酶基因进行蛋白质表达，并利用高通量的筛选方法，快速而有效地测试基因 库中的各个突变体。通过多次迭代逐渐筛选出催化活性、特异性、稳定性更好的酶变体，并 能够特异性识别修饰碱基及维持核酸生物合成的高保真度。 1.6.5 基因合成与克隆 1. 基因合成技术 基因合成是一种人工合成DNA或 RNA序列的技术，旨在构建具有特定功能或性质的生 物分子。该技术在合成生物学、基因工程、医学研究等领域得到广泛应用，为生命科学的发 展带来了前所未有的机遇。化学合成的寡核苷酸序列一般长度低于200个核苷酸，且随着寡 核苷酸链的增长，化学合成的产率变低，而且合成错误率也随之升高。因此，为了合成成百 上千个碱基的基因序列，需要充分结合寡核苷酸的化学合成和生物合成方法来开发基因合成 技术，主要包括以下几种策略和方法。 (1)逆转录基因合成：对构建已知的目标基因，可以通过提取细胞中的mRNA,并 将 mRNA逆转录成DNA片段。然后利用一对目标基因序列末端的寡核苷酸引物，通过PCR扩 增全长的基因序列，实现基因的合成。如果需要对上述基因进行个别单碱基突变，可以用上 述合成的基因作为模板，再利用含有定点突变的寡聚核苷酸引物进行二次PCR扩增，从而 完成单碱基突变的基因合成。相对于基因的从头合成，逆转录基因合成可减少合成基因的成 本。但是这种基因合成方法只适用于天然存在的基因序列和个别位点碱基突变的基因合成。 对于多位点突变或重新设计的基因序列(如mRNA疫苗和蛋白替代的mRNA药物),基因的 从头合成策略是一个更好的选择。 (2)基因的从头拼接：限于基因编码序列的长度规模，难以直接合成足够长的核酸片 段。目前最常用的策略是采用酶促反应，将一系列短的寡核苷酸片段拼接成较长的基因序 列，包括连接介导的组装和PCR介导的组装两种方法。连接介导的组装( Ligation-mediated assembly)利用热稳定性的DNA连接酶，通过连接酶链式反应( ligase chain reaction,LCR) 来构建完整的基因编码DNA序列。通常根据基因编码序列设计完全覆盖基因序列的多个寡 核苷酸序列，再通过化学合成法合成所有设计的互补配对寡核苷酸且在5'端引入磷酸基团修 饰。将上述交叉互补的寡核苷酸片段与热稳定的DNA连接酶混合并加热变性，混合物逐渐 降温至合适温度，DNA连接酶开始将各个相邻寡核苷酸片段的3'端羟基和5'端磷酸基团连 接形成磷酸二酯键。加热变性和退火连接的步骤可循环重复，最终再利用一对基因序列末端 的寡核苷酸引物，通过PCR扩增全长的基因序列，实现基因的合成。由于最后一步采用了 PCR的方法扩增目标基因序列，连接酶介导的组装反应显著减少了寡核苷酸片段的需求，降 低了合成成本。 PCR介导的组装( PCR-mediated assembly)是通过PCR介导的拼接反应将一系列有重 叠区域的寡核苷酸序列，逐步扩增产生全长的基因，此类方法也被称为“聚合酶循环组装”。 化学合成的寡核苷酸片段被设计成互为模板和引物，其与dNTPs、DNA聚合酶、缓冲液混合 后，在类似于PCR的热循环条件下扩增，逐渐形成越来越长的DNA片段，并最终达到全长 基因序列。同连接酶介导的基因合成方法类似，最后一步利用一对基因序列末端的寡核苷酸 引物，通过PCR扩增得到大量全长的基因序列。PCR介导的基因拼接反应中，寡核苷酸的 重叠区域仅需15~25nt, 进一步减少化学合成的寡核苷酸使用，降低基因合成成本。然而， 由于DNA聚合酶固有的特性(保真性/错配率),PCR介导的基因拼接反应中催化扩增产物具 有更高的错误率且难以用于具有一系列重复序列和/或过多二级结构的基因。 寡核苷酸的固相化学合成可以根据核苷酸的序列依次偶联，但化学合成的重大缺点就 是难以合成长链的DNA分子。而基因的拼接合成需要首先通过化学合成和纯化几十个寡核 苷酸，再通过DNA连接酶或聚合酶来构建长链的DNA分子。不同于大多数DNA 聚合酶，来 源于免疫细胞的一种称为末端脱氧核苷酸转移酶( TdT) 的DNA聚合酶可以在没有模板的 情况下工作，在DNA 分子的末端随机添加新的碱基(图1.52)。因此控制TdT每次只添加 一个特定碱基的核苷酸将解决TdT的随机延长DNA的问题。将要添加的碱基核苷三磷酸共 价连接在TdT 上，根据基因的序列每次只添加一个碱基核苷酸修饰的TdT。但 DNA偶联上 特定核苷酸后，其整个序列的3'末端被锚定在TdT 上，使TdT无法再继续随机添加碱基。 随后再通过不同的反应(如还原、光解和多肽酶水解等)将延伸的寡核苷酸从TdT 上剪切 下来并更换反应体系，再添加新的核苷酸修饰的TdT,从而根据序列要求依次合成。目前利 用上述从头合成技术合成的最长DNA序列为1005个碱基的核苷酸，只够编码300个左右 氨基酸的蛋白质。当然，用生物合成的方法来定制基因的DNA仍然处于起始阶段。随着生 物技术的发展，特别是聚合酶的工程化改造，未来有望实现对基因DNA的直接从头生物 合成。 图1.52 基于TdT的基因从头合成方法。 基因合成在合成生物学领域发挥着巨大的作用。通过设计和构建人工基因调控系统、生 物元件和合成生物学电路，可以实现对生物系统的精准调控，创造具有新功能的生物分子， 甚至可以设计和构建人工基因组，实现对细胞的重新设计和建造。在生物医学领域，基因合 成为定制医学和基因治疗提供了新的可能性。通过设计和合成适用于特定患者的基因治疗药 1.6 核酸的合成与修饰 153 物，有望实现对特定疾病的精准治疗。随着生物存储技术的发展和对存储数据量的需求，大 片段DNA的高效精准合成为DNA存储技术提供了新的途径。将大量的信息存储在DNA中 成为可能，为数据存储领域带来了革命性和颠覆性的创新。 2. 分子克隆与基因组组装 无论是通过化学合成的几十个碱基的寡聚核苷酸的拼接或扩增还是基因从头合成，均 需要采用PCR的方法扩增最终产物。因此，出于合成的困难和确保序列保真度的考虑，最 终合成的DNA一般控制在5kb之内。而基因组的大小在几十甚至几百kb, 无法通过直接的 寡核苷酸拼接得到，更不可能从头合成。为了实现更大基因组片段的组装，目前可以采用基 因组的连接酶链式反应组装法( ligase chain reaction,LCR),基因组聚合酶组装法( genome assembly by polymerase extension, GAPEx)、Gibson组装( Gibson assembly) 、Golden Gate组装 和无缝克隆法( in-fusion cloning)(图1.53)。 图1.53 基因组的组装方法。 (1)基因组的连接酶链式反应组装法( ligase chain reaction,LCR): 基因组的连接酶链式 反应组装法是一种基于连接酶的高效基因组组装方法。这种基因组组装方法类似于片段拼接 的基因合成法，利用连接酶将基因组中的DNA片段通过连接互补序列的方式精确组装在一 起。连接酶组装法的关键在于发现这些互相重叠的片段，随后连接酶能够特异性识别这些配 对重复序列，并选择性地连接含有这些特定互补序列的DNA片段。这种特异性使得LCR能 够更加精准地组装基因组，减少连接错误的可能性。这一步骤可以进行多次，形成更长的连 接片段。通过同时进行多个连接反应，不同的DNA片段可以在同一时间内连接，显著提高 了组装效率。这种高效性特别适用于大规模基因组的组装，使得LCR成为应对复杂生物体组 装挑战的有力工具。 (2)基因组聚合酶组装法：基因组聚合酶组装法(genome assembly by polymerase extension, GAPEx)是一种利用DNA聚合酶进行组装的高效基因组组装方法。这种基因组组装方法类 似于寡聚核苷酸的PCR基因合成法，将经过测序的长DNA片段用作组装的基本单元。根据 各个片段的序列设计引导序列，并使之在不同的DNA片段上具有互补性。聚合酶通过模板 和引导序列的配对，进行链的延伸，从而实现DNA片段的连接。在GAPEx中，聚合酶在不 同的温度下可以实现不同引导序列的引导和延伸，并完成基因组的组装过程。一般可以将 2~6个长DNA片段按比例混合，以此作为模板，以最外侧两端的寡核苷酸作为引物，进行 重叠延伸，同时要保证相邻的两个DNA片段之间有20~40bp 的同源重叠区，经PCR后得到 连接完成的DNA片段。聚合酶组装法可以通过调整温度循环的参数、优化引导序列的设计 来提高组装的效率和精确度，并且避免了向基因组中插入无意义序列和相同黏性末端产生的 自连接，减少了组装错误的可能性。但上述组装法操作仍较为烦琐，一般不会用于拼接超过 100kb的基因组核酸序列。 (3) Gibson组装法：Gibson组装法是一种高效的DNA片段组装方法，广泛应用于分子 生物学和合成生物学领域，不仅能够无缝组装DNA片段，还允许在组装的同时进行基因编辑和 插入。Gibson组装法主要使用三种酶：5'→3'外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶(图1.54)。 协同作用使得DNA片段在无须引物的情况下，能够高效、特异地连接在一起。其中5'→3' 外切酶负责在DNA双链片段的5'端生成外切切口，切除部分5’末端的碱基，外切酶切除核 苷酸后的单链序列配对形成双链。随后DNA聚合酶在切口处进行DNA合成，再通过连接酶 的作用连接相邻DNA片段。要实现基因Gibson组装，同样需要在长链DNA片段两侧进行 设计，确保相邻片段的末端有20~40个碱基的重叠区域。在50~55℃的温度下，将设计好 的DNA片段与三种酶混合在一起后，DNA片段的重叠区域会被外切酶切割，生成的裸露 黏性单链末端彼此配对结合。DNA聚合酶随即沿3'单链末端合成DNA,修补退火片段缺 口。DNA连接酶最后将相邻的DNA片段切口连接，形成闭合的DNA分子。Gibson组装尺度 可以大于100kb, 能够更高效、更方便地进行基因组的组装，是目前最常用的基因组组装 的方法。 末端重叠的dsRNA片段 完全组装的DNA 图1.54 Gibson 组装的原理。 1.6 核酸的合成与修饰 I 55 (4) Golden Gate 组装：传统的酶切连接方法利用限制性内切酶(例如EcoRI) 识别 4~8bp的DNA回文序列，并在识别序列内部切割产生黏性末端或平末端。与传统的酶切连 接方式不同，Engler等人提出了一种新型的Golden Gate载体构建法。该方法利用限制内切酶 (例如Bsal) 在DNA的识别序列以外进行剪切，产生四个碱基的黏性末端(图1.55)。被剪 切出的黏性末端序列与内切酶识别无关，因此可直接作为DNA质粒形成的连接片段。经过 精准的序列设计，最终质粒中不会出现识别位点，从而实现高效、精确的无缝克隆。此外， 四个碱基的黏性末端共有256种碱基排列方式，除去16种回文序列，还有240种非回文序列 可供选择，用以减少黏性末端自连。因此，在连接酶的作用下可实现单片段重组或多片段重 组。在合适的实验条件和实验设计下，利用Golden Gate方法可以组装超过20个DNA长片段。 图1.55 Golden Gate 组装的原理。 (5)无缝克隆( in-fusion cloning): 无缝克隆和组装技术是一种新型、快速、简洁的克 隆方法。该方法不需要任何限制性内切酶和连接酶，也不需要磷酸化、末端补平等限制，可 在质粒的任何位点插入一个或多个目标DNA片段。In-Fusion酶能够识别线性化的DNA片段 5'-3'末端任意16碱基，使其形成黏性末端。目标质粒通过酶切或者PCR线性化后，也能被 In-Fusion 酶识别。因此，无缝克隆是通过识别DNA片段和线性化载体末端的15碱基对的同 源序列，将目标DNA片段和线性化载体高效精确地连接在一起(图1.56)。无缝克隆技术突 破传统的双酶切限制，再加上连接，只需要载体和基因形成的黏性末端互补，通过退火的过 程即可得到高效率克隆的重组载体。 基因克隆是一项重要的分子生物学技术，可以将特定的DNA片段从一个生物体(源生 物体)复制到另一个生物体(宿主生物体),允许科学家复制、研究和利用特定的DNA片 段，是解决许多生物学问题的有力工具。基因克隆的过程包括DNA提取、切割、连接、转 化、筛选和表达等多个步骤。 图1.56 无缝克隆。 基因克隆首先通过机械破碎、化学法或酶解等方法从源生物体中提取包含有整个 基因组信息的DNA, 进而使用限制性内切酶识别特定的DNA序列并从提取的DNA 中切 割出需要的特定目标片段，生成特定的DNA片段。其次选择一个能在宿主生物体中具 有自主复制能力的质粒载体(常见的质粒载体包括pUC19,pBR322), 通过限制性内 切酶在预定的位置切割，生成可接受目标基因的末端。随后将切割好的目标基因片段 或者通过人工合成的基因组片段和载体片段通过连接酶的作用接在一起，形成一个完 整的DNA分 子 ，即重组质粒。但得到的重组质粒需要进一步导入宿主生物体(如大肠杆 菌，酵母，昆虫细胞，植物细胞和部分哺乳动物细胞)进行转化和复制外源DNA。为了 筛选出成功转化的细菌，通常在培养基中加入特定抗生素，只有带有重组质粒的细菌能 够生存，并从中挑选成活的菌落进行基因测序来确证重组质粒成功导入。最后再将成功 筛选的菌落进行培养，提取含有目标基因的重组质粒，进而用于后续的转录和蛋白质翻 译的研究和应用。 | 1.7 核酸与分子相互作用 小分子与核酸的共价相互作用在1.4.3中已有论述，本节主要讨论其他分子与核酸的碱 基、磷酸二酯键和沟区的非共价相互作用。 1.7 核酸与分子相互作用 I 57 1.7.1 核酸与小分子的相互作用 1.DNA与小分子相互作用 小分子可以通过氢键、静电相互作用、嵌插作用等方式与DNA相互作用。 (1)氢键：在双链DNA中，除了碱基对之间的Watson-Crick 氢键配对，在大沟中还有 嘌呤碱基的N7位、腺嘌呤的N6-H、胞嘧啶的C4-NH、鸟嘌呤的C6-0 、胸腺嘧啶的C4-0, 小沟中有腺嘌呤的N3、鸟嘌呤的C2-NH、嘧啶的C2-0 等位点能够与其他分子形成氢键。 例如Im/Py聚酰胺分子，就是在小沟内通过与碱基的氢键相互作用，实现对特定DNA序列的 选择性识别与结合的(图1.57)。 大沟区域 Py-T/C相互作用 Py-A 相互作用 大沟区域 Hp-T 相互作用(高特异性) 大沟区域 Im-G 相互作用(高特异性) 图1.57 Im/Py 分子对不同碱基对的特异性识别和结合作用。 图1.58 一价金属阳离子通过配位键稳定G- 四分体。 (2)静电相互作用：DNA的磷酸二酯键生理条件下带有负 电荷，能够与带有正电荷的金属阳离子、含氮的碱性有机化合 物等通过静电相互作用而结合。 金属阳离子的存在对于稳定DNA双螺旋结构具有重要作用。 金属阳离子除了与磷酸二酯键的静电相互作用外，还能够与碱基 上的0原子、N原子通过形成配位键而相互作用。例如，G- 四分 体中心的一价阳离子(如K*和Na+)能够与四个鸟嘌呤形成配 位键，对稳定G-四分体结构具有重要作用(图1.58)。 含氮的碱性有机化合物质子化以后带正电荷，能够与磷酸 二酯键通过静电相互作用，稳定DNA双螺旋结构，并帮助DNA 分子在细胞内凝缩。例如，组蛋白富含赖氨酸和精氨酸，在生理条件下质子化带正电荷，因 此能够通过静电作用结合双链DNA形成核小体，并进一步凝缩成染色质存储于细胞核中。 细胞核内高浓度的精胺和亚精胺，也能够通过静电作用结合DNA, 对维持DNA的正常生理 功能具有重要作用。 (3)嵌插作用( intercalation): 具有芳香稠环的平面分子能够插入双链DNA 相邻的碱基 对之间，通过与碱基对之间的π-π相互作用及疏水作用力，形成稳定的复合体。小分子对 双链DNA的嵌插结合导致DNA双螺旋解链和伸长，严重影响DNA的正常生理功能。例如， DNA染色剂溴化乙锭( EB) 就是通过对DNA的嵌插作用，导致荧光信号增强，实现对DNA 的定量检测。溴化乙锭由于对DNA功能的强烈干扰，可致畸和致癌，现已较少使用。 小分子与双链DNA的识别与结合一般都是多种作用力综合作用的结果。例如，抗肿瘤 药物Dactinomycin与DNA结合就包括芳香大环对双链DNA的嵌插作用，环肽部分在沟区通 过氢键、范德华力与碱基相互作用等(图1.59)。 1.7 核酸与分子相互作用 159 dactinomycin dactinomycin与DNA结合结构 红色：dactinomycin 绿色：G-C 碱基 蓝色：A-T 碱基 黄色：磷酸二酯/糖骨架 图1.59 抗肿瘤药物放线菌素D(dactinomycin) 与双链DNA的结合模式。 2.RNA与小分子的相互作用 对于RNA双链区域，它的大沟相比于DNA更加窄而深，而小沟则更加宽而浅，因此双 链RNA的沟区不利于小分子结合。除了双链区域，RNA还具有凸起、内部环、发夹等多种 二级结构，从而形成复杂多样的三维空间结构，有利于小分子通过多种作用力实现对这些区 域的特异性结合。例如，氨基糖苷类抗生素卡那霉素与细菌16SrRNA的 A位点内部环区域 通过静电、氢键等相互作用形成复合物，干扰细菌蛋白质的合成，从而达到抗菌功效。链霉 素能够选择性识别并结合HIV TAR RNA中的凸起结构，抑制Tat蛋白反式激活作用，达到抑 制HIV病毒复制的效果。 综上所述，小分子可以通过对碱基的嵌插作用及沟区的氢键、静电、范德华力作用，实 现对双链DNA的非特异性或者序列特异性结合。对RNA则主要与凸起、内部环、发卡结构 区域相互作用，实现对这些结构的选择性靶向。小分子与核酸的相互作用和结合主要具有三 大类应用价值：①靶向结合核酸的小分子本身可以作为药物，广泛应用于抗肿瘤、抗菌、抗 病毒等领域，例如顺铂、阿霉素、链霉素等；②小分子与核酸结合能够实现对核酸的标记和 成像分析，例如EB,SYBR Green等；③能够与靶核酸进行特异性结合的小分子还可以用作 探针分子，实现对细胞内生命过程的调控。 1.7.2 核酸与蛋白质的相互作用 核酸与蛋白质的相互作用广泛存在于生命活动的调节中。基因的复制、转录、翻译、修 饰等过程都离不开核酸和蛋白质的相互作用。 1. 核酸结合蛋白的功能与分类 核酸结合蛋白( NABPs)是一类能够结合核酸的蛋白质。核酸结合蛋白主要协助实现以 下几种生理功能：一是与核酸组装成活性复合体，例如染色质中的组蛋白和病毒中的衣壳蛋 白等；二是辅助核酸的运输和定位；三是参与核酸的代谢过程，例如复制、转录、DNA修 复、重组等；四是基因表达调控作用，例如DNA甲基化酶、去甲基化酶等。 序列非特异性的DNA结合蛋白(如DNA聚合酶、连接酶)一般以孔道围绕DNA或以 深的狭缝结合DNA,主要通过静电、氢键与核糖-磷酸骨架的相互作用实现稳定的结合。序 列特异性的DNA结合蛋白(如大多数的转录因子，限制性内切酶和DNA修复酶)则一般 螺旋-转角-螺旋结构域 红色为亮氨酸 图1.60 常见的序列特异性的DNA 结合结构域。 在沟区通过与碱基的氢键相互作用，实现 对特定序列选择性结合。常见的序列特异 性的DNA结合结构域包含以下几种：螺 旋-转角-螺旋( helix-turn-helix, 例如大 肠杆菌的LacZ阻遏物)、锌指结构域( zinc finger domain,例如小鼠的Zif268结构)、 亮氨酸拉链结构域( leucine zippers,例如酵 母的转录激活因子GCN4) 等(图1.60)。 RNA结合蛋白通过RNA结合结构域(RNA binding domain,RBD) 与RNA互作，形成 核糖核蛋白复合体( ribonucleoprotein complex),直接或间接地参与RNA相关生物过程。RNA 结合结构域的关键位点为RNA结合基序，常见的RNA结合基序有RNA识别基序[ RNA- recognition motif,也被称为核糖核蛋白结构域( ribonucleoprotein domain, RNP)] 、KH基序 (K homology motif)、dsRNA结合基序( dsRNA-binding motif,dsRBM) 等。除此以外，有些 DNA结合结构域也可以与RNA结合，例如锌指蛋白TFⅢA可同5s rRNA结合。 2. 核酸与蛋白质结合的分子间作用力 核酸结合蛋白主要通过盐桥(静电相互作用)、氢键、π效应等作用力与核酸结合(图161)。 核酸结合蛋白多富含精氨酸和赖氨酸，特别是精氨酸在生理条件下通过侧链的质子化而 带正电荷，它们能够与核酸上带负电荷的磷酸二酯键通过静电相互作用而结合。蛋白质上其 他残基(如天冬氨酸)也能够通过与其配位的金属离子，基于静电相互作用实现与磷酸二酯 键的间接相互作用。蛋白质侧链与磷酸二酯键之间的静电相互作用与碱基无关，因此不具有 序列依赖性，但是该作用力对蛋白质与核酸的结合具有重要贡献。 静电相互作用 Arg-G Gln-G π一π相互作用 图1.61 蛋白质-核酸相互作用的静电、氢键和π一 π相互作用。 序列特异性的核酸结合蛋白主要通过侧链与碱基之间的氢键相互作用实现对靶序列的特 异性识别与结合。具有极性侧链的精氨酸、赖氨酸、丝氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺 等残基是与核酸碱基形成氢键作用的主要位点。 1.7 核酸分子相互作用 I 61 核酸链末端核苷酸与蛋白质的复合体，以及碱基切除修复酶与核酸损伤底物的复合 体中，一般都存在核酸碱基与氨基酸侧链的π相互作用。例如，在尿嘧啶DNA糖苷酶 (Uracil-DNA Glycosylase,UDG) 对 DNA链中脱氧尿苷的切除修复机制中，脱氧尿苷翻转 180°,从双螺旋结构中翻转出来。UDG酶活性中心的苯丙氨酸通过π-π堆积作用稳定该 尿嘧啶碱基，促进下一步的糖苷键水解反应。除了具有芳香侧链的苯丙氨酸、酪氨酸、色 氨酸和组氨酸外，质子化的精氨酸侧链也能够通过阳离子-π相互作用与核酸的碱基进行 结合。 3.蛋白质与核酸相互作用的研究技术 在体外，可以利用生物物理和生物化学的方法测定蛋白质与核酸的结合常数，确定核 酸结合蛋白在核酸上的结合位点。常用的生物物理手段有等温滴定量热(isothermal titration calorimetry, ITC) 、微量热泳动( microscale thermophoresis, MST)、表面等离子体共振 (surface plasmon resonance, SPR)、电镜、核磁共振、X射线衍射等。常用的生物化学手段包 括电泳迁移率实验( electrophoretic mobility shift assay,EMSA)、DNA足迹分析( DNA footprinting assay)、光交联下拉及蛋白质质谱鉴定、生物芯片技术等。 用于细胞内核酸-蛋白质相互作用研究的方法不多，其中染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation, ChIP) 被广泛应用于鉴定DNA结合蛋白在染色质DNA 上的结合位点 (图1.62)。ChIP的基本原理是首先用甲醛处理活细胞，使结合在一起的蛋白质与核DNA之 间产生共价交联。其次通过超声或酶处理将DNA断裂为小片段。然后通过靶蛋白的特异性 抗体下拉蛋白质-DNA 共价复合物，特异性地富集靶蛋白结合的DNA片段。最后化学逆转蛋 白质与DNA之间的交联，释放DNA片段，最后通过测序及比对，确定靶蛋白在染色质DNA 上的结合位点。 甲醛处理细胞， 产生共价交联 裂解细胞、提取总DNA 抗体与DNA孵育后结合 免疫沉淀 洗脱交联产物 图1 .62 ChIP的流程图。 ChIP流程烦琐，周期长，需要的细胞数量多。近年来，核酸酶靶向切割和释放( CUT & RUN)、靶向剪切及转座酶技术( CUT&Tag) 作为两种更为高效的染色质分析技术，得到了 应用推广。CUT &RUN采用蛋白A-MNase融合蛋白对DNA结合蛋白两侧的DNA进行原位 靶向切割，将靶点DNA片段选择性地从细胞核中释放出来进行测序分析。CUT&Tag方法中 用到了蛋白A融合的超高活性Tn5转座酶。这种融合蛋白能够与靶蛋白抗体结合，在抗体附 近切割DNA,并插入带有接头序列的短标签(标签化)。与ChIP相比，CUT &RUN和CUT & Tag不需要交联、染色质片段化和免疫沉淀，因此简单易行，周期短，成本更低。CUT & RUN是大多数情况下染色质分析的理想工具，而CUT&Tag则是低样本量应用的更优选择。 CLIP(UV crosslinking and immunoprecipitation) 和CLIP衍生技术iCLIP、eCLIP和PAR- CLIP等是研究细胞内RNA-蛋白质相互作用的主要手段。CLIP技术采用紫外光照射细胞， 诱导RNA与RNA结合蛋白共价交联。然后使用RNA结合蛋白对应的抗体进行免疫共沉淀， 捕获靶标RNA。在获得的RNA上连接测序接头后，反转录进行建库测序，最后对结果进行 生物信息学分析，确定RNA结合蛋白在RNA上的结合位点(图1.63)。 光交联RNA与结合蛋白 裂解细胞 RNA降解 免疫沉淀 3加接头 纯化RNA- 蛋白复合体 蛋白酶降解 制备cDNA 5加接头 高通量测序 图1.63 CLIP的流程图。