Beyond PEGylation：聚肌氨酸(PSAR)在ADC领域的应用

2024-02-16

抗体药物偶联物引进/卖出并购

聚乙二醇化(PEGylation)作为目前应用较为广泛的药物赋形剂，可大幅增加前体药物的亲水性，降低肾小球滤过，延长体内停留时间；此外，PEG修饰的纳米载体可通过空间排斥作用提高胶束稳定性[1]。尽管自1973年以来，PEG就被FDA列为“公认安全”食品成分，但越来越多的研究报告称PEG对动物和人类具有免疫原性。抗PEG抗体对聚乙二醇化制剂的体内性能产生显著影响，其中在重复施用聚乙二醇化蛋白质和纳米载体制剂时广泛观察到加速血液清除的现象。抗PEG IgM与后续剂量的聚乙二醇化制剂之间的相互作用诱导补体激活，促进单核吞噬细胞系统(MPS)的识别和快速清除，同时引起过敏反应症状(HSR)；抗PEG IgG可直接与先天免疫细胞上的FcγR结合以诱导HSR (图1)[2, 3]。这些现象已在临床前和临床上得到不同程度的体现。由于抗PEG抗体产生的机制尚在研究中，临床上减少抗PEG抗体影响的方法主要依靠调整给药方案、应用辅助药物、PEG封端处理等。图1 抗PEG抗体的产生机制及其生物学效应从药剂学领域来看，根本途径是寻找一种具有相似理化性质和药代动力学优异但免疫反应不显著的相容性聚合物。作为亲水性聚合物，聚肌氨酸(Polysarcosine, PSAR)逐渐进入药物研发人员的视野。PSAR，即聚(N-甲基甘氨酸)，由肌氨酸(肌肉组织中的内源氨基酸)组成，类似于聚丙氨酸，具有高度水溶性；甲基取代的酰胺基团对蛋白质表现出有限亲和力，从而阻止血栓形成；氢键供体的缺失也赋予PSAR非免疫原性，因为氢键供体似乎对于与抗体发生反应至关重要；除链具有一定的刚性外，PSAR具有与PEG相似的聚合物特性，抑制体内巨噬细胞的摄取，延长制剂的血液循环时间；此外，PSAR对非特异性蛋白质吸附和细胞附着具有出色的抵抗力，它可以稳定血流中的纳米颗粒，并能在体内的癌症部位积聚[4-6]。PSAR目前多用于脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体等领域，在抗体偶联药物(ADC)领域应用较少。基于ADC良好的临床应用前景及其有效载荷水溶性较差的限制因素，本文选取具有代表性的文章/专利重点介绍PSAR在ADC领域的应用。此方面具有代表性的企业包括MabLink、Novartis、Multitude Therapeutics (普众发现)等。 01 MabLink2023年10月18日，MabLink Bioscience宣布与礼来达成收购协议，成为其全资子公司。Mablink主要致力于开发ADC药物，其专有的亲水性药物连接技术PSARLink™能够设计具有高DAR值(DAR 8/16)的同质、血浆稳定的新一代ADC，同时保持优异的药理学特性和耐受性[7, 8]。针对ADC有效载荷疏水性问题，PSARlink™平台具有独特的“隐身”技术，通过在Linker上添加聚肌氨酸链构建创新型亲水性Linker，"掩盖"有效载荷的疏水性，使它们能在体内停留更长时间，从而促进对肿瘤细胞的杀伤作用、拓宽ADC治疗指数的潜力(图2A)。图2. PSARlink™平台技术及其应用PSARlink™平台最早应用于靶向于HER2 ADC的制备，以Trastuzumab (Tras)作为模式抗体进行概念验证实验(图2B)[9]。利用强亲水性的PSAR作为疏水性掩蔽实体，构建含有MMAE的树枝状的Linker-Payload，同时还含有β-葡萄糖醛酸酶响应性自降解单元，通过还原抗体链间二硫键制备具有良好理化和药理学特性的高负载(DAR8)均质ADC，经β-葡萄糖醛酸酶激活后在癌细胞内释放MMAE，发挥肿瘤杀伤作用。图3. ADC-PSAR的PK及其活性研究体内活性研究表明，ADC-PSAR12和ADC-PSAR0在BT-474乳腺癌模型中的抗肿瘤活性与其观察到的PK行为直接相关(图3B)。单剂量3 mg/kg的ADC-PSAR12能够明显抑制肿瘤生长，可引起肿瘤完全消退(4/5 CR)，而ADC-PSAR0则不能。在相同剂量下，T-DM1 (Kadcyla®)对肿瘤生长基本上没有抑制作用。在Sprague-Dawley大鼠中对其PK特性进行研究，探究Linker-payload的构效关系。受试ADC的暴露量随着PSAR长度的增加而增加，PSAR最多可达12个单体残基，进一步延伸PSAR对ADC的清除率几乎没有影响，ADC-PSAR0和ADC-PSAR12L (直链)显示出较差的PK特性(图3C)。在相同长度下，与PEG相比，PSAR能够更有效地提高清除率。上述ADC (2.5 mg/kg)的抗肿瘤活性在乳腺癌模型BT-474中进行活性研究，仅在具有低清除率的偶联物(ADC-PSAR12和ADC-PSAR18)中观察到肿瘤完全消退，就MMAE而言，12个单体的PSAR长度似乎是最优值(图3D)。尽管ADC-PSAR24具有出色的清除率，但其活性并不理想，可能是因为24个单体PSAR长度最终会产生过大和/或受阻偶联物，阻碍肿瘤渗透，干扰内化或β-葡萄糖醛酸酶消化过程，并最终导致观察到的抗肿瘤活性损失。具有较差(ADC-PSAR12L)或次优(ADC-PSAR6和ADC-PEG12)清除特性的ADC只能在测试剂量下抑制肿瘤生长(图3D)。这些结果证明在相同长度下，与PEG相比，PSAR能够更有效地提高ADC抗肿瘤活性(ADC-PSAR12与ADC-PEG12)。该部分内容所用的Linker-Payload囊括在专利WO2019081455[8]中。该专利使用逐步的树脂上亚单体方法获得具有特定链长的离散型单分散PSAR均聚物，较传统方法-由肌氨酸N-羧酸酐(NCA)或肌氨酸N-硫代羧酸酐(NTA)的缩合开环聚合反应-廉价、易于大规模生产、并能赋予终产物可接受的收率和优异的单体纯度并用于蛋白质偶联物技术，避免PSAR以多分散体形式在药物递送领域所面临的不必要的麻烦。此外，单分散PSAR均聚物为配体-药物-缀合物(LDC)提供改进的载药能力、药代动力学和治疗功效。图4. WO2019081455专利解析及其代表性LDCWO2019081455专利利用化学合成的方式构建多种直链型或支链型Linker-Payload，其中Payload涉及MMAE、SN38、PNU159682和依喜替康，PSAR链的长度不一，再以定点偶联的方式构建具有特定DAR值(8/16)的ADC (图4)。具体的体内实验实施例与上述文章一致，此处不再赘述。针对含有PNU159682的Linker-Payload构建靶向HER2的ADC，MabLink就其分支Linker未进行披露，仅知道该Linker是不可裂解的(图5)[7]。体外ELISA实验表明，含有两种不同Linker的ADC对HER2的结合活性不受Linker-Payload引入的影响，对HER2+ NCI-N87、SKBR3、MDA-MB-361、BT-474细胞系展现出良好的体外效力，Linker A的活性比Linker B高5-10倍。基于此，以Linker A构建的ADC (ADC-PNU-PSAR10-A)进行体内实验，结果表明ADC-PNU-PSAR10-A (1 mg/kg)可引起肿瘤完全消退，T-DM1 (Kadcyla®, 4 mg/kg)未能诱导肿瘤消退(图5B)。图5. PNU-159682不可裂解ADC的构建及其体内活性除了以T-DM1 (Kadcyla®)作为阳性对照进行抗肿瘤活性测试[9]，还以DS-8201a DS-8201a (Enhertu®)作为阳性对照进行活性测试(图6)[10]。针对拓扑异构酶I抑制剂Exatecan的疏水性，通过PSARlink™平台技术引入单分散PSAR，有效降低ADC的整体疏水性，ADC与未偶联抗体具有相同药代动力学特征。体内实验表明Tra-Exa-PSAR10在NCI-N87异种移植模型中表现出强大抗肿瘤活性(1 mg/kg)，优于DS-8201a DS-8201a；同时在100 mg/kg的剂量下在小鼠中具有良好的耐受性(图6B)。体外实验表明，这种基于Exatecan的ADC表现出比DS-8201a DS-8201a更高的旁观者杀伤作用，并在临床前HER2+乳腺癌 HER2+乳腺癌和食管癌模型中克服了对T-DM1的耐药性，表明在异质性和耐药性肿瘤中具有潜在活性。总之，基于PSAR的疏水性掩蔽方法可以生成高DAR值的含Exatecan的ADC，其具有优异的理化性质、改善的药代动力学特征和有效的体内抗肿瘤活性。图6. 基于PSARlink™平台技术构建的Exatecan ADC的活性评估基于PSARLink™平台技术，MabLink目前共计开发出多款ADC产品，其中MBK-103[11]进展较快。MBK-103靶向叶酸受体α (FOLR1)，DAR=8，其由Fc减弱的人源化IgG1单克隆抗体、聚肌氨酸疏水性掩蔽实体、专有的二肽可裂解单元和Exatecan组成。MBK-103在人血浆中表现出优异的离体稳定性，可延长半衰期，与未缀合的单克隆抗体类似，可导致药物暴露增加，在十多个具有不同FOLR1表达的体内小鼠肿瘤模型中观察到有效的抗肿瘤功效，剂量低至1-3 mg/kg。此外，Exatecan独特的作用模式以及专有PSARLink™平台的独特特性使其在结直肠癌模型中也有一定的体内抗肿瘤效力，而微管蛋白抑制剂仅表现出有限的治疗效果。该ADC在食蟹猴中具有良好的耐受性，最高非严重毒性剂量(HNSTD)可达50 mg/kg，甚至重复给药也是如此。MKB-103于2023年第四季度提交IND，计划于2024年Q4进行I期临床试验。 02 Novartis 诺华针对包含亲水性基团的Linker-Payload的ADC制备专利目前共检索到两篇: WO2020236841[12]和WO2020236825[13]，两篇专利以同日(2020年5月19日)进行申请。其中WO2020236841主要以含有PEGylation、寡糖、PSAR、磷酸(酯)、多肽等修饰的Linker-Payload的构建为主，以PSAR修饰的Linker-Payload包含不同的长度及末端基团(图7A)，但在具体的实施例中所构建的靶向P-钙黏蛋白ADC中并未含有PSAR的修饰；专利WO2020236825主要涉及含MCL-1抑制剂的ADC的制备及应用，同WO2020236841类似，构建不同集团修饰的Linker-Payload (图7B)，同样在具体的实施例也未构建含有PSAR修饰的ADC。相信在不久的将来诺华将会公布含有PSAR修饰ADC的活性结果。图7. WO2020236841、WO2020236825中PSAR修饰的Linker-Payload (部分) 03 普众发现(Multitude Therapeutics) 普众发现(Multitude Therapeutics)医药科技有限公司于2019年6月成立于上海和硅谷，该公司同时在开发CAR-T、双特异抗体(BsAbs)和ADC。该公司开发的MabArrayTM和T moiety平台技术用于ADC药物的开发，MabArrayTM用于发现新颖的细胞表面抗肿瘤靶点以构建First-in-Class ADC的抗体部分；T moiety则用于开发Linker-Payload，克服Exatecan因其过强的疏水性导致无法直接偶联抗体的困难，并赋予ADC更强的旁观者效应和肿瘤浸润能力。T moiety ADC技术平台是一种高亲水性自裂解Linker修饰技术，展现出更优的“疏水屏蔽效应”与稳定性，与现有的ADC相比大幅度提高ADC的治疗效果，延长药物作用时间，同时能够克服多重肿瘤耐药性，更重要的是毒副作用并没有增加，从而进一步提升现有ADC药物的治疗窗口。T moiety-Exatecan ADC的研究进展在Cancer Discovery杂志在线发表-“Antibody-exatecan conjugates with a novel self-immolative moiety overcome resistance in colon and lung cancer”，详尽揭示了DS-8201a DS-8201a (及其他DXd家族ADC)和TRODELVY的耐药机制，并且以此为基础进行新型的ADC的开发[14]。文章比较多个因素-亲水性修饰(PEG、PSAR)、多肽(VC、VA、GGFG)-对Linker-Payload的影响(图8)。对于T moiety而言，对其进行修饰处理-None、甲氨基甲基(T800)、PEG8 (T900)和PSAR (T1000)，以Tras作为模式抗体进行偶联，评估不同Linker-Payload的理化性质及活性。在聚集稳定性方面，相较于PEGylation修饰，PSAR10修饰的T1000/T1001所构建的ADC具有可忽略不计的聚集水平(尤指T1000)；同时，间甲基氨基甲基修饰的T800可构建出高DAR的均质ADC，其聚集程度也在可接受范围内；相比之下，T800和M800二者化学等效，但所构建形成的ADCs聚集程度相去甚远，该结果表明T-moiety可作为最佳修饰位点(图8C)。通过一系列筛选，表明T800-T1000的修饰比经典的PEGylation更有优势。图8. 不同T-moiety修饰的ADC构建及其稳定性评价文章中作者利用T1000偶联技术，进一步在多个成药靶点上（HER2, TROP2, HER3, CDH6）进行“头对头”的抗肿瘤活性药效实验，评估MTX-1000的体内抗肿瘤活性。药效学模型包含多种适应症(肺癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌等)、多种模型类型(细胞源性异种移植模型-CDX、人源肿瘤异种移植模型-PDX、同基因小鼠模型)、不同多药耐药(MDR)特征，同时针对所研究靶点的表达量高低以及癌症主要基因突变类型进行抗肿瘤活性评价(图9)。通过近乎全面的体内药效数据，充分证明通过T moiety技术构建的ADC相比现有的含DXd/SN-38的ADC具有更加优异的抗肿瘤活性和更宽广的适用性。图9. T moiety-Exatecan ADC抗肿瘤活性普众发现基于T moiety技术平台开发了三款ADC药物，其中AMT-707 (CUSP06)[15]信息批露较多，靶向钙粘蛋白-6 (CDH6)，DAR=8，CUSP06在体外对CDH6+癌细胞系表现出很强的抗增殖活性，利用CUSP06处理CDH6+ CDX模型(PA-1、OVCAR3和786-O)可引起肿瘤抑制。此外，CUSP06在CDH6Low/High PDX模型中表现出强大的抗肿瘤活性并能引起肿瘤消退。2022年6月8日，普众发现与昂阔医药(OnCusp)签署合作协议共同开发和商业化CUSP06[16]。根据许可协议条款，OnCusp获得在大中华区以外的全球范围内独家开发和商业化CUSP06的权利，普众发现将获得预付款、开发、注册和销售里程碑付款以及分级特许权使用费。CUSP06的临床前活性为CUSP06未来的临床开发提供了强有力的支持，该项目计划于2023年下半年进行I期临床试验，用于铂类难治性/耐药性晚期实体瘤(卵巢癌)患者，但目前尚未有信息进一步披露。目前，基于PSAR修饰的ADC还处于起步阶段。虽然该种修饰较PEGylation有更低的免疫原性，但可能会因给药频次、用药周期等产生抗PSAR抗体，应当对抗PSAR IgM和IgG的准确阳性率和水平进行检测与研究，更好地促进PSAR修饰在疾病治疗领域的应用。主要参考文献 1. Yadav, D. and H.K. Dewangan, PEGYLATION: an important approach for novel drug delivery system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, 2021. 32(2): p. 266-280.2. Zhang, P., et al., Anti-PEG antibodies in the clinic: Current issues and beyond PEGylation. J Control Release, 2016. 244(Pt B): p. 184-193.3. Fu, J., et al., Anti-PEG antibodies: Current situation and countermeasures. 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