可逆共价抑制剂（reversible inhibitor)

2024-05-19

侃言共价抑制剂一般是指不可逆共价抑制剂；但是细分研究，可以分为不可逆共价抑制剂（ICIs）、和可逆共价抑制剂（RCIs）。这次仅聊聊可逆共价抑制剂。谈谈它的重要特征、设计规则、分析方法、以及Case Study（JAK3、BTK、EV71）、和发展展望。化合物定制1共价“喜”与“忧”共价抑制剂已经有一百多年的发展历史，相关研究有迹可循。多年以来，共价抑制让人欢喜让人忧！喜的是，共价抑制剂有非共价抑制剂（NCIs）不具有的优势：1、延长抑制剂靶向靶标蛋白的停留时间，具有抗耐药性；2、抑制传统意义上的“不可成药”靶标。包括那些具有延展的、或浅而平坦的口袋、或者根本没有口袋的靶标，以及参与蛋白质交互作用（PPIs）的大而平坦的功能作用界面。3、靶向蛋白靶标双重选择模式，赋予药物亲和力元件额外的亲和力，增强靶向效力。这是因为共价抑制一般包括两个步骤：先是如同非共价抑制的那般，抑制剂亲和性结合靶标蛋白；随后和靶标反应性氨基酸残基形成共价键，通过不可逆失活的自杀式抑制、或者通过形成共价加成物增加亲和力使抑制剂获得更强的竞争性抑制活性。共价弹头提高了抑制剂对靶标蛋白的亲和力粘性，抑制剂和靶标氨基酸残基的反应可以是永久性不可逆的，也可以是暂时性可逆的；不可逆共价抑制剂如同胶水般将亲和力元件和靶标永久性粘合在一起，而不可逆共价抑制剂好比是在抑制剂和靶标之间绑了个“活扣”，还可复原。因此，如上图，影响NCI、ICI、RCI平衡常数的因素不同。以上共价抑制的优势使其重新复兴。但是共价自身的特点，也给研究人员带来了一些担忧。从结构上看，共价抑制剂由亲和性元件、和反应性弹头构成。因此，担心它过分活力四射、脱靶，伤害了“无辜的”蛋白质靶标。ICIs还是永久性伤害；RCIs也会“伤害无辜”，但可逆性动力学致使它还会“释放无辜”。担心它的稳定性，经不起血浆或体内代谢过程中复杂环境的考验，提前“失活”，甚至反应性官能团在代谢过程中带来毒性。一些包含有活性基团的成分进入到血浆和体内，一般表现出较差的药代动力学和较低的稳定性。担心它导致免疫激活，如抑制剂与蛋白形成的加合物或者降解产物导致过敏反应等。以上的担忧曾一度限制了共价药物的发展，研究人员多是追寻着一条经验主义的黄金法则——开发可逆性药物，即非共价抑制剂。然而，即使是非共价抑制剂，也有很多因为毒性而退出了历史的舞台。也有大量的共价药物在治疗中发挥着举足轻重的作用。因此，对共价抑制不利的担忧完全可以变成研发中设计和攻克的目标。在药物开发中，研究人员致力于扩大药物的治疗效力，而降低其副作用。对于共价抑制剂来说，脱靶问题、以及药代动力学问题、和代谢稳定性问题是不可避免的，需要在药物开发过程中予以解决。2可逆共价抑制的化学结构特征和优势共价抑制剂的亲电弹头大多时候都比较明显，具有显著的结构特征，如具有环张力的β-内酰胺、α,β-不饱和羰基化合物等；还有一些隐藏在前药中，在代谢后才崭露出共价结构，如奥美拉唑等；还有一些，通过结构观察不是很明确，但在机理验证中证实为共价机制，如作为异柠檬酸裂解酶3的共价抑制剂3-硝基丙酸、作为磷酸肌醇-3激酶共价抑制剂的Wortmannin等（上图）。对于可逆共价抑制剂，反应动力学使它对“无辜的”靶标可逆的、非永久性的修饰，最后还是会释放抑制剂和“无辜者”，因此，这就减轻或者避免了脱靶效应及其毒性。符合可逆共价抑制剂的弹头近些年来也有一定的发展，如上图。靶向靶标氨基酸残基的作用机制不同，主要可以分为3类：1、靶向半胱氨酸残基类主要有α-氰基丙烯酰胺及其衍生物、氰基类、醛基类、α-氟取代丙烯磺酸酯、氟氯双取代甲基酮、巯甲基四氮嗪等。2、靶向丝氨酸/苏氨酸残基类主要有α-羰基酰胺、硼酸等。3、靶向赖氨酸残基及N末端类主要有醛基，另外有邻位羟基提供氢键稳定，或者硼酸提供氢键配位稳定亚胺结构。如下图，是近些年报道的一些发现的可逆共价抑制剂，红色标记的是可逆共价弹头。如上图，是可逆共价抑制的两步过程：亲和力结合、可逆成键。很明显，可逆共价抑制不会永久性改造蛋白靶标导致其变性等，因此一定程度上减轻了共价抑制的脱靶、和免疫激活的风险。这类弹头的反应性会更弱，在血浆和体内的稳定性相对于ICIs也会有所改善。等式中K代表平衡常数，τ代表抑制剂-靶标加合物的停留时间，研究人员的目标是获得的共价抑制剂，其Ki*尽可能地小，而τ尽可能地大。3可逆共价弹头的生化分析怎样确定抑制剂是可逆共价抑制剂呢？对机制地研究和确认，肯定不能仅靠经验从化学结构上判断。需要验证抑制剂弹头与靶标残基的可逆性反应、活性确定、保留时间测定、脱靶效应评估等。这些都需要一定的技术支持。3.1 可逆性分析可逆性的确认相对比较容易解决，一般可以通过①核磁共振（NMR）的技术方法、②质谱（MS）的方法、③生物发光共振能量转移（BRET）的方法等来确认。NMR法：对比RCI-Target加合物与未结合靶标的RCI的NMR化学信号，很容易区分两者的差别。稀释共价加合物的NMR样品浓度，如果是可逆共价结合，体系会重新平衡，降低加合物的浓度，获得更多的未结合的RCIs。此外，如果结合物或者RCIs具有明显的紫外/可见光谱信号，也可以通过这种方法确定Kd。MS法：将共价加合物注射进质谱分析仪，在MS试验的过程中，加合物会分解，抑制剂和天然蛋白会被释放，能过够在MS谱上观察到。BRET法：利用生物发光共振能量转移的竞争抑制试验，联合冲洗试验法验证可逆共价。首先蛋白靶标被共价抑制剂饱和性结合，然后引入荧光追踪试剂，用来取代共价抑制剂，如果能够竞争性取代，则共价抑制为可逆共价抑制的动力学结合。此外，共价抑制剂-蛋白加合物降解或者变性以及随后的抑制剂的复原，也进一步证明是可逆共价抑制。3.2 停留时间分析可逆共价抑制剂（RCIs）的停留时间可以通过荧光竞争法、或药代动力学/药效学（PK/PD）分析来测定。3.3 脱靶效应评估共价抑制不可避免的需要面临和解决脱靶效应的毒性问题，因此，对于共价抑制剂的脱靶效应评估至关重要，确定哪些蛋白质可以与共价抑制剂形成加合物，目前主要有三种方法报道。经典方法包括：与放射性标记的抑制剂共孵育，随后进行凝胶层析、电泳、切胶并进行Edman测序、进而鉴定出氨基酸-抑制剂加合物。现代化的方法包括质谱的方法：对目标兴趣蛋白进行分离（如色谱法、电泳法）后共价修饰分析（如果修饰位点已知，则可不进行蛋白消化；如果修饰位点未知，则需要进行蛋白消化）。化学蛋白质组学是另一种探测共价抑制剂脱靶效应的方法：通过标记可逆共价抑制剂（如亲和、荧光、或放射标记等），可以分离分析加合物（如使用亲和标记从凝胶中分离，或使用荧光或放射性标记从凝胶中分离）。这种方法已经应用于识别药物发现中的靶标化合物，也可以用于识别脱靶蛋白。需要指出的是，共价加合物的存在并不意味着与之联系的一定是不利的影响。脱靶加合物的识别可以为副作用的假设提供证据，但脱靶加合物的成分如果未知，必须进行进一步的探索，说不定会有意想不到的发现！4可逆共价抑制剂设计开发有效的可逆共价抑制剂，需要考虑一系列的问题：必须要有一个共价弹头；共价弹头必须对特定的亲核性残基有一定的选择性；共价加合物必需是可逆的；共价药物对期望靶标需要有良好的亲和结合力；一个好的可逆共价抑制剂具有一些通性，因此对于最佳可逆共价抑制剂的设计有如下一个总结性的通用流程，如上图所示。Step 1: 计算分析和虚拟建模。通过计算分析和虚拟建模确保靶标具有一个适合不可逆共价抑制剂靶向的亲核性残基（如丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、或者N末端氨基等）；但是计算分析和虚拟建模这一过程对于RCIs的成功开发不是必需的，尤其是对于没有靶标高质量结构数据的情况下；目前已有一些RCIs的建模理论框架，以及利用量子力学（QM）、QM/分子力学（MM）、或者QM/MM结合分子动力学方法进行建模试验。Step 2: 结合质量作用定律描述生成物和反应物的平衡状态。引入质量作用定律，通过动态平衡和停留时间评估抑制剂-靶标的结合动力学。平衡有利于共价加合物的形成；脱靶效应的逆反应的热力学有利性；如果解离常数Ka较小时，可逆性和不可逆性抑制剂没有差异；优化靶向酶和脱靶酶的停留时间等。Step 3: 抑制剂与可逆性共价抑制剂结合动力学的相似性。包括抑制剂沿着动力学描述的表征；测定组蛋白脱乙酰酶4进行生化表征后的光谱学试验方法；其他方法还有洗涤后进行标记追踪（如JAK3抑制剂）、胰蛋白酶消化后抑制剂复原等。Step 4: 抑制剂-谷胱甘肽结合物不可长期积聚。谷胱甘肽与亲电性应激有关；必需有高度的可逆性才能避免应激反应；进行竞争性谷胱甘肽消化试验以解决应激反应的问题。Step 5：最小化全局应激反应。共价抑制可能导致蛋白质错误折叠，如果是非特异性的共价抑制剂，可能会导致全局蛋白错误折叠应激反应。通过共价抑观察蛋白错误折叠应激；确保有限的脱靶效应。Step 6：对免疫细胞的影响。除了有效的靶标结合外，开发共价抑制剂的一个重要考虑因素是对免疫细胞的影响。免疫细胞对亲电应激高度敏感，可引起免疫刺激或免疫抑制作用。因此，检测抑制剂对b细胞、t细胞和巨噬细胞作用，以确定抑制剂是否引起促炎或抗炎。细胞因子的表达和分泌，对于避免免疫激活的潜在并发症很重要。5可逆共价抑制剂设计Case Study5.1 蛋白激酶类——JAK3抑制剂Janus激酶（JAK）是介导细胞信号反应的关键调控酶，特别是在涉及免疫细胞反应的细胞因子信号的分泌中。人类有四类JAK亚型，包括JAK1、JAK2、JAK3、以及TYK2，每一个都高度相似，因此开发高选择性药物非常具有挑战性。目前临床上已经开发了泛-JAK抑制剂，如FDA批准的tofacitinib (上图Comp. 5），但是其多亚型抑制效果还不清晰，特别是不同的JAK亚型在免疫健康中作用不同。研究发现JAK3拥有一个独特的半胱氨酸残基（Cys909），其余亚型在相同位置的残基为丝氨酸，因此选择性靶向的共价抑制剂的设计将非常具有潜力。利用上图中新开发的不可逆共价抑制剂1-3、已知的不可逆JAK3共价抑制剂化合物4、以及两种已知的非共价JAK3抑制剂5、6，研究人员表征和确定了新型的、具有较好活性（低nM)、和选择性(>500倍)的不可逆JAK3共价抑制。抑制剂1-3虽然具有良好的体外抑制活性，但是他们的亲电弹头在进攻JAK3之前发生了脱靶反应，导致不良反应。因此，研究人员基于化合物7的多环骨架进行可逆共价抑制剂设计，并与弹头反应性官能团饱和等价物进行对比，发现可逆共价抑制设计的抑制活性是饱和等价物的4倍以上。包含有可逆共价抑制弹头的13、14对JAK3具有良好的抑制活性（127 pM、154 pM）以及相对于其他亚型的高选择性（400倍到5800倍）。5.2 蛋白激酶类——BTK抑制剂BTK是与抗体信号和免疫细胞募集相关的免疫调节反应的关键酶，在大多数造血细胞中表达BTK，在B细胞的信号级联反应中起关键作用，是一种重要的免疫治疗靶点。BTK还有半胱氨酸残基，而类似的激酶还有丝氨酸，为设计选择性靶向的共价抑制剂提高了先天性条件。如上图，ibrutinib、acalabrutinib、zanubru-tinib、和tirabrutinib是已获批的BTK不可逆共价抑制剂，靶向Cys481残基。虽然他们对BTK具有很强的抑制作用，但是与Cys481相似的半胱氨酸的激酶也容易产生不可逆的抑制作用，造成脱靶。对此，研究人员开发了可逆共价抑制剂rilzabru-tinib。通过脱靶效应测试，其脱靶的副作用得到了很好的限制，目前已经进入了临床II/IIIq期研究。5.3 蛋白水解酶类——EV71 cPro 抑制剂蛋白水解酶（又称蛋白酶）存在于所有的生命结构域中，而蛋白水解酶抑制剂已广泛应用于抗癌、抗菌、高血压、2型糖尿病、阿尔兹海默病、非酒精性脂肪肝、和纤维化治疗中。蛋白水解酶一般根据其催化反应性残基进行分类，不同类型的作用机制不同，因此，可逆共价抑制剂可以作为选择性靶向抑制剂设计的有效工具。针对蛋白水解酶，临床上已经有不少成功的可逆共价抑制剂开发。如针对苏氨酸蛋白水解酶可逆共价抑制剂Bortezomib、Ixazomib；丝氨酸蛋白水解酶可逆共价抑制剂Boceprevir、Saxaglibtin、Telaprevir；半胱氨酸蛋白水解酶可逆共价抑制剂Nirmatrelvir等；最近一个关于半胱氨酸蛋白水解酶可逆共价抑制剂的开发的例子是肠病毒71(EV71）——用于治疗手足口病相关病原体之一。Rupintrivir是一个已知的EV71同源人源鼻病毒的不可逆共价抑制剂，共价弹头为靶向半胱氨酸残基的丙烯酸乙酯。研究人员对Rupintrivir的共价弹头进行修饰，得到共价化合物15-22，以期待获得对EV71 3C蛋白水解酶具有高效力、可逆的、选择性共价抑制剂。其中，分别选择了α-羰基-N-丙基乙酰胺、醛基、丙烯酰胺甲酯/甲胺、α-卤素取代丙烯酰胺甲酯、α-氰基取代丙烯酰胺基甲氨基叔丁基甲酸酯、α-氰基取代丙烯酰叔丁酯等作为共价弹头。研究人员利用MS检测抑制剂的可逆性，通过动力学拟合数据，检测靶标的活性。展望近年来，随着技术的发展，已经能够很好地解决共价抑制带来的脱靶效应、代谢稳定性等导致的毒性，以及药代动力学等问题，共价抑制剂再次兴起，其中一种就是开发可逆共价抑制剂（RCIs)。在RCIs的开发过程中，可以充分利用质量作用定律，其中一系列反应的平衡取决于底物的活性和浓度。其结果是，在稳态下，产物的浓度(如靶蛋白的同价加合物)将依赖于其他副反应的平衡。通过设计一种强结合抑制剂，平衡将最终导致抑制期望的目标，而非目标抑制是不利的。虽然脱靶结合会发生，但共价加合物的可逆性将限制脱靶结合的表型后果。从不可逆的共价抑制到可逆的共价抑制，显著的脱靶效应被规避，药物更安全;采用可逆性共价抑制将使有希望的药物很少因脱靶反应而产生明显的副作用。除了药物设计和酶抑制，可逆共价加合物也已被用于细胞成像、和材料科学(这里以动态共价键的名义)。RCIs未来的发展，包括：改进建模，以准确识别足够的非催化的亲核残基，以形成加合物；改进非丙烯酰胺弹头反应的反应性和可逆性的规则或指南，并开发强有力、易于执行的检测方法，以检测来自亲电应激的意外免疫反应；此外，还有新型亲电弹头的发现，特别是如果它们可以很容易地用荧光团或放射性标签进行修饰，以方便在细胞内或体内进行定位等。参考文献ACS Chem. Biol.2024, acschembio.3c00805.https://doi.org/10.1021/acschembio.3c00805.声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手觉得本文好看，请点这里↓