杰克说药是著名药史专家Jie Jack Li(李杰)教授专为同写意打造的药林外史精品专栏,将讲述一个个药物发现背后的故事。李杰教授先后出版了30本有机和药物化学方面的书籍以及药物发现史,其中10本与诺奖得主E. J. Corey合作完成。其《Blockbuster Drugs》一书获2015 Alpha Sigma Nu Science Book奖,并被翻译成中文出版,深受欢迎。
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对于致病蛋白,如果可以降解,为什么还要抑制它呢?
蛋白降解已成为治疗癌症和其他疾病的新型手段。目前,存在多种靶向蛋白降解方式,本系列内容聚焦关注两个最重要的类别:分子胶降解剂与蛋白水解靶向嵌合体(PROTACs)。
在上篇,我们先来看分子胶降解剂。
顾名思义,分子胶降解剂的作用机制,就是如同胶水般将两种蛋白的表面结合在一起。通过诱导接近,分子胶促进靶蛋白与泛素连接酶之间的协同作用,最终导致靶蛋白被泛素化并经蛋白酶体降解。
分子胶降解剂是小的、类似药物的化合物,因此更像药物,符合利平斯基的五法则。
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施赖伯和刘钧在哈佛
分子胶现象最早由刘钧于1991年发现,当时他作为博士后研究员在哈佛大学斯图尔特·施赖伯实验室工作,距今已有约35年。
刘钧利用亲和色谱技术发现,环孢素A(一种免疫抑制剂,也是常见抗生素)具有分子胶功能,能同时结合两种蛋白:环孢素结合蛋白和蛋白磷酸酶钙调神经磷酸酶。与此同时,另一种免疫抑制剂FK506也被发现具有分子胶功能,可同时结合FK506结合蛋白(FKBP)和钙调神经磷酸酶。1
施赖伯的事迹被巴里·沃思1994年著作《十亿美元分子》所载入史册。刘钧现任约翰霍普金斯大学著名教授。
斯图尔特·施赖伯和刘钧
为了解蛋白降解的工作原理,我们首先必须研究一种非常小的蛋白,泛素。
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泛素:一个诺奖蛋白
细胞内的蛋白并不像人们长期以来认为的那样是静态的。相反,它们处于“动态状态”——不断被合成和降解,以维持蛋白稳态。
蛋白降解的一条途径是通过溶酶体(lysosome)。溶酶体是1955年比利时生物化学家克里斯蒂安·德·杜夫发现的一种细胞器,他还发现了另一种重要的细胞器,过氧化物酶体(peroxisome)。
由于这些发现,1974年,德杜夫与比利时裔美国细胞生物学家阿尔伯特·克劳德 、罗马尼亚裔美国细胞生物学家乔治·帕拉德一起获得诺贝尔奖。三人实际上绘制出一幅细胞及其多种细胞器的功能地图,并揭示了这些细胞器之间如何相互交流的通路,即所谓的分子转运(molecular trafficking)。
溶酶体包含了多种降解酶,可以通过自噬(autophagy)来降解细胞质内的蛋白。而斯坦福大学的2022年诺贝尔化学奖获得者卡罗琳·贝尔托齐发明的靶向溶酶体嵌合体(LYTACs),能够降解膜蛋白和胞外蛋白。
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来自海法的赫什科
最初,人们认为蛋白降解主要依靠溶酶体的自噬作用完成,并且缺乏特异性。
但科学家后来证实,溶酶体只参与胞外蛋白的更新——大多数细胞内蛋白的降解并非通过溶酶体水解,而是依赖另一种非溶酶体机制:泛素–蛋白酶体系统(ubiquitin–proteasome system, UPS)。该系统负责降解细胞内大部分蛋白。
揭示这一点的关键发现,来自阿夫拉姆·赫什科及其同事们历时三十余年的努力。
赫什科1937年出生于匈牙利,1947年,即以色列建国前一年,他和家人移居以色列。1969年在耶路撒冷希伯来大学获得医学博士/博士学位后,赫什科在加州大学旧金山分校做博士后研究时,被“蛋白在细胞内如何被降解”所吸引。
当时,赫什科被安排研究酪氨酸转氨酶的降解。而大多数同行,尤其是他在加州大学旧金山分校的实验室同事,对蛋白降解并无兴趣。分子生物学的中心法则仍是“教条”,研究热点集中在 RNA翻译成蛋白的过程。即使在蛋白研究领域,关注点也主要放在蛋白合成,而不是降解。
可蛋白的分解与合成同样重要,因为细胞必须维持蛋白稳态才能存活。在加州大学旧金山分校,赫什科发现酪氨酸转氨酶的周转被氟化钾——细胞ATP生成抑制剂——完全被抑制。他的结果印证了几年前已有报道的结论:蛋白降解是一个依赖能量的过程。2
1971年从旧金山回到以色列后,赫什科在地中海沿岸小城海法新成立的以色列理工学院担任教职。学校规模很小,研究条件有限,但他仍然坚持研究细胞内的非溶酶体蛋白降解及其机制。起初,研究非常困难,因为缺乏能够利用经典生物化学方法研究细胞内降解的无细胞体系。
1975年,NIH下属福格蒂中心举办的一次会议上,赫什科遇到了著名酶学家欧文·罗斯,后者在费城福克斯蔡斯癌症研究所担任研究员。
这次幸运的邂逅,促成一段长达22年的合作,并最终带来了诺贝尔奖。借助福克斯蔡斯癌症研究所的先进设备,赫什科在那进行休假研究。罗斯还鼓励赫什科申请NIH的拨款,以资助他在海法的蛋白降解项目。
一个重要的突破发生在1977年。
哈佛医学院的阿尔弗雷德·戈德堡做出一项划时代的发现:他利用兔子未成熟红细胞(网织红细胞)提取的无细胞体系,能降解异常血红蛋白。网织红细胞没有溶酶体,但它们可以分解细胞内蛋白。作为一种可溶性ATP依赖性蛋白水解系统,兔网织红细胞被证明是纯化和表征参与细胞内蛋白降解的酶的重要来源。
然而戈德堡并未深入追踪这条路线,结果错失了诺贝尔奖。3
相比之下,赫什科立即意识到戈德堡网织红细胞系统的价值,并利用了它们选择性降解异常血红蛋白的能力。
在制备放射性标记的网织红细胞裂解物后,赫什科先去除了占总细胞蛋白85%的血红蛋白。通过填充有阴离子交换树脂的色谱柱洗脱粗网织红细胞提取物,他收集了两个成分。有趣的是,单独的每个部分都无法降解底物蛋白,但当二者重新组合,ATP依赖的蛋白水解活性又奇迹般恢复。
后来,这一观察对阐明复杂的蛋白降解机制产生了深远影响,研究花费十余年才得以完全揭示。
02
泛素:一个非常小的蛋白
1977年,来自海法的研究生阿龙·切哈诺沃加入赫什科新成立的研究小组。他被分配的任务是进一步纯化并表征第一个成分,而事实证明这一点至关重要。第一个成分作为一种红色提取物,除了残留血红蛋白这一主要污染物外,仅含有一个单一的“活性”蛋白。
努力纯化该活性蛋白的过程中,切哈诺沃意外地发现,第一个成分的降解活性在加热后仍能保留。鉴于该活性蛋白似乎具有耐热性,他萌生了一个“疯狂”的想法,并趁导师赫什科在美国休假研究之际付诸实践。
切哈诺沃将第一个成分在沸水中加热十分钟,结果大部分血红蛋白像泥浆一样沉淀下来,而黄色上清液则保留全部的蛋白降解活性。此后,上清液的纯化变得容易得多,从而解决了一个长期存在的技术难题。
经过额外两轮柱层析,切哈诺沃最终获得一种均一蛋白,并将其命名为ATP依赖的蛋白水解因子-1(ATP-dependent proteolysis factor-1, APF-1)。APF-1显示出相当不寻常的特性:它具有耐热性,但看起来确实是蛋白。其分子量为8.5 kDa,是一个非常小的蛋白。
当赫什科和切哈诺沃将研究成果提交至著名的《生物化学杂志》时,稿件却被拒绝,理由是他们的实验“过于简单”。最终,他们只好将其发表在一个较次要的期刊——《生物化学与生物物理研究通讯》。他们当时并不知道,这篇论文日后会成为该领域的经典里程碑之作。4
但是,APF-1到底是什么?它的功能又是什么?当他们为这些问题苦苦思索却一筹莫展时,机缘巧合帮了他们的忙。
1980年,切哈诺沃与赫什科在福克斯蔡斯癌症研究所的一位博士后合作,发现放射性标记的APF-1居然能够与另一种更大的蛋白共价结合。随后,罗斯的另一位博士后基思·威尔金森被招募来确定APF-1究竟是什么。
威尔金森在与邻近实验室的一位博士后闲谈时得到灵感:至少有一个类似的先例被报道过。人们已知,组蛋白A24可以通过酰胺键(amide bond)与一种叫做泛素(ubiquitin)的小蛋白发生共价修饰。
在这一启发下,威尔金森与另外两位福克斯蔡斯癌症研究所的博士后合作,最终确认,APF-1其实就是泛素。5
泛素:蛋白降解剂,由集邮局提供 - 以色列邮报
泛素最早于1975年由纽约大学的吉迪恩·戈德斯坦从胸腺中分离出来。起初,戈德斯坦认为泛素是一种胸腺激素。他之所以将其命名为“ubiquitin”(意为“普遍存在”),是因为他觉得这种蛋白在原核和真核细胞中普遍表达。后来事实证明,这是一个误称,泛素实际上只存在于真核生物中。然而这个名字还是被保留下来。6
泛素是一个由76个氨基酸组成的小蛋白,分子量仅8.5 kDa,是人类已知的进化最为保守的真核蛋白之一。在人类、鳟鱼、果蝇等截然不同的生物中,其序列完全相同。正因如此,它特别适合担任细胞内一个至关重要的功能:作为蛋白降解的辅因子。
在1980年之前,泛素的功能一直不为人所知,直到在福克斯蔡斯癌症研究所被发现与APF-1是同一种物质时才揭示出来。
这是一次极其重要的发现。不仅直接洞穿泛素与其底物之间通过酰胺键相连的本质,还阐明了ATP的作用机制,从而解开蛋白降解为何需要能量的谜团。泛素的研究,又推动另一个关键发现——由三类酶协同作用的共轭机制,负责蛋白的降解。
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蛋白酶体:巨型蛋白与细胞的垃圾处理系统
既然第一个成分已经确定,那么第二个成分又是什么呢?这是赫什科和切哈诺沃在1980年代面临并最终解决的问题。
简言之,第二个成分是通过色谱洗脱后再经盐析分离得到的。纯化出的蛋白被发现是一种ATP稳定蛋白,分子量约450 kDa,比泛素大50倍以上。赫什科和切哈诺沃很快确定,它就是蛋白酶体(proteasome),该结构早在1970年代初就已被认识。
哺乳动物的26S蛋白酶体,属于一种巨大、能量依赖的细胞质蛋白酶,负责降解被泛素标记的蛋白。泛素和26S蛋白酶体都是蛋白周转的关键介质,提供成为泛素系统特异性蛋白水解工具臂的所有必要标准。
这也合理解释了,为何最初从网织红细胞获得的两个馏分单独无活性,而在重新组合后却能恢复蛋白水解活性——因为它们分别是泛素和蛋白酶体。
顺带一提,蛋白酶体抑制剂如今已成为重要的抗癌药物,用于治疗多发性骨髓瘤。B细胞与T细胞、NK细胞同为白细胞(淋巴细胞),当机体受到病毒或细菌入侵时,B细胞负责分泌抗体。T细胞则可在合适的条件下,调动免疫系统识别并消灭癌细胞。
蛋白酶体对维持细胞蛋白稳态至关重要,它通过降解错误折叠、受损或不需要的蛋白,参与多种细胞过程。此外,它还在细胞信号传导(例如降解IκB以激活NF-κB)、细胞增殖(例如降解细胞周期蛋白及其CDK抑制因子,以促进细胞周期进程)等方面发挥活跃作用。抑制26S蛋白酶体可能导致细胞凋亡。
目前已有三种蛋白酶体抑制剂上市,均用于治疗多发性骨髓瘤:
• 硼替佐米(bortezomib,商品名Velcade):由Millennium Pharmaceuticals(现已并入武田)研发,2003年获批,是first-in-class的蛋白酶体抑制剂,也是人类第一个获批的含硼药物。此前,“药物不应含硼”几乎被视为一种教条。
• 艾沙佐米(ixazomib,商品名Ninlaro):由Millennium、武田开发,2015年获批,用以接替即将专利到期的硼替佐米。
• 卡非佐米(carfilzomib,商品名Kyprolis,2021年获批):由安进推出,是一种源自天然产物的共价抑制剂,起初被耶鲁大学的克雷格·克鲁斯发现。
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蛋白降解机制
在1980年代初期,发现泛素和蛋白酶体共同参与蛋白降解是一个重大的成就。但要想弄清楚泛素–蛋白酶体系统(UPS)究竟是如何分解蛋白的,还花费了整整十年时间。
1981至1983年间,赫什科及其同事鉴定出一组参与UPS蛋白降解的三类酶。他们发现,泛素可以通过酰胺键共价连接到靶蛋白的赖氨酸残基上,这一过程称为泛素化(ubiquitination或ubiquitin ligation)。该过程由三类酶依次完成:
• E1:泛素激活酶(ubiquitin-activating enzymes)
• E2:泛素结合蛋白(ubiquitin-conjugating proteins)
• E3:泛素–蛋白连接酶(ubiquitin–protein ligases)
在人类中,E3连接酶的数量超过700种,这解释了为何蛋白降解具有如此高的特异性。
赫什科团队进一步揭示UPS的工作方式:它是一个三步级联机制。首先,泛素由E1激活并转移给E2;随后,靶蛋白被一个或多个泛素分子“标记”。一旦蛋白被标记,就等于被打上了“死亡之吻(kiss of death)”,向26S蛋白酶体发出销毁信号,而这一过程由E3连接酶催化完成。
1980年代后期,麻省理工学院的亚历山大·瓦尔沙夫斯基研究组,首次发现泛素系统的生物学功能,并揭示其特异性的来源。他们还表明,泛素系统对活细胞内大部分蛋白的降解至关重要,而不仅仅是赫什科和切哈诺沃在无细胞体系(cell-free systems)中观察到的那部分。
可见,UPS对细胞生存不可或缺,并在许多细胞过程(如细胞周期)中发挥重要作用。7
由于这些重要贡献,瓦尔沙夫斯基一度与赫什科、切哈诺沃一起被并称为“调控性胞内蛋白水解领域之父”。三人还共同获得了包括拉斯克奖在内的多个著名奖项。然而,在2004年诺贝尔奖评选中,瓦尔沙夫斯基并未和赫什科、切哈诺沃共同获奖。诺奖委员会在其“无上的智慧”下,选择了罗斯作为第三位获奖者。
阿夫拉姆·赫什科、阿龙·切哈诺沃和欧文·罗斯
诺贝尔委员会将2004年的化学奖授予赫什科、切哈诺沃和罗斯,赞扬他们在阐明泛素–蛋白酶体系统的蛋白降解机制方面所做的贡献。令人惊叹的是,赫什科与切哈诺沃竟能在以色列这样一个小国、资源有限的环境中,完成如此原创且杰出的实验性研究。
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1. Liu, J.; Farmer, J. D.; Jr., Lane, W. S.; Friedman, J.; Weissman, I.; Schreiber, S. L. Calcineurin is a common target of cyclophilin-cyclosporin A and FKBP-FK506 complexes. Cell 1991, 66, 807–815.
2. Matyshevska, O. P.; Grigorieva, M. V.; Danilova, V. M.; Komisarenko, S. V. Ubiquitin and its role in proteolysis: the 2004 Nobel prize in chemistry. Ukrainian Biochemical Journal 2022, 94(5), 84–96.
3. Goldberg, Alfred L. Nobel committee tags ubiquitin for distinction. Neuron 2005, 45(3), 339–344.
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5. Wilkinson, Keith D. The discovery of ubiquitin-dependent proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005, 102(43), 15280–15282.
6. Goldstein, G.; Scheid, M.; Hammerling, U.; Schlesinger, D. H.; Niall, H. D.; Boyse, E. A. Isolation of a Polypeptide That Has Lymphocyte-Differentiating Properties and Is Probably Represented Universally in Living Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1975, 72, 11–15.
7. Varshavsky, Alexander The early history of the ubiquitin field. Protein Sci. 2006, 15(3), 647–654.