mRNA疫苗开发之30年历程

2022-10-01

信使RNA疫苗抗体免疫疗法

摘要：90年代早期，首创性使用mRNA疫苗作为治疗工具。在接下来的几十年里，对mRNA药理学有了进一步了解，同时在免疫学方面的新见解，使得mRNA相关技术成为新一代疫苗候选者。本文概述了mRNA疫苗的历史和现状，同时从免疫学角度评价了mRNA疫苗的开发。本文中我们强调了疫苗设计、检测和管理方面的挑战以及mRNA相关疫苗设计中的关键因素和将mRNA包装在纳米疫苗中所带来的新机遇。最后，我们讨论了mRNA自佐剂效应，其作为一个关键的两面性参数，决定了诱发免疫反应的安全性、有效性和强度。介绍：mRNA疫苗开发的第一步利用mRNA作为新型治疗药物的概念产生于1989年，位于San Diego的Vical公司宣布了其成功。他们表明将mRNA包裹入脂纳米颗粒可以成功将mRNA转移至各种真核细胞。几个月以后，Wolff等指出其实验中裸mRNA可以直接注射入小鼠肌肉。其实，这原本是作为脂质递送实验的对照进行的。裸mRNA肌肉注射几天后可检测到编码蛋白表达。该实验第一次证实了活体组织中通过体外转录mRNA方式可以将遗传信息用于制造蛋白质。重要的是，该过程无需病毒或非病毒载体，这与mRNA体内稳定性的假说大相径庭。这使得mRNA可成为质粒DNA有价值且安全的替代者。因为，mRNA只有成为胞质溶胶才能在核糖体上进行翻译，这避免了其整合入宿主基因组的风险。mRNA除了具有暂时性取代错误蛋白的治疗性用途外，20世纪90年代初期提出mRNA可提呈抗原信息至抗原提呈细胞。Martinon第一次展示了包含mRNA的脂质体可编码流感病毒核蛋白诱导病毒特异性细胞毒T细胞反应。除了细胞免疫，Conry表明体液免疫也被激活，其表明编码癌胚抗原的mRNA预防类疫苗最终诱导抗肿瘤抗体反应产生。经过30年研究，mRNA疫苗已迎来新局面，很多候选疫苗已进入临床试验阶段。本综述中，我们将列出最重要的基础内容以便于我们理解mRNA疫苗是如何制备和递送的。我们将对不同mRNA疫苗平台间免疫结果进行讨论，可能会为诱导更有效、安全免疫反应带来帮助。mRNA疫苗的免疫观点1973年Ralph Steinman和Zanvil Cohn发现树突细胞（DC）不久，该细胞就被鉴定为启动T细胞反应的辅助细胞。DC专职化摄入、处理、提呈蛋白抗原至淋巴细胞，连接固有和适应性免疫。DC中的抗原信号可源于胞质，包括MHC I提呈的抗原多肽或来自溶酶体被装载在MHC II经内化、吞噬而来的隐藏抗原。这些MHC复合物，包括装载胞内抗原的MHC I和胞外抗原的MHC II，随后可分别被CD8+T细胞或CD4+T细胞的T细胞受体识别。除了这些抗原信号，DC还为抗原特异性T细胞活化提供了必要的共刺激信号。最终，活化的CD8+CTL能够选择性清除表达外来抗原的细胞，如被病毒感染的宿主细胞，表达异常蛋白的肿瘤细胞。CD4+辅助T细胞可以协同促进CTL活性。为了实现体液免疫，B细胞需要通过BCR识别体外抗原以及通过与活化辅助性T细胞（MHC II途径）的相互作用产生多功能、高亲和力抗体。树突状细胞是如何根据抗原的来源和细胞内部位置，通过特异性募集不同的效应细胞来引发免疫反应，这一知识促进了使用不同类型抗原开发(癌症)疫苗的研究。mRNA是一种吸引人的抗原使用抗原编码mRNA的一个关键优点是其提供了诱发MHC I提呈和诱导CTL反应的简单方式。与病毒感染类似，反转录mRNA在胞质中形成选择抗原的瞬间表达和积累。随后其被充分处理为多肽，进入MHC I途径。至此，胞质内少量mRNA分子能确保进一步抗原提呈至CTL，而蛋白只能依赖于低效的交联提呈途径。有趣的是，mRNA抗原也可以靶向MHC II途径。这发生在mRNA表达蛋白分泌和再循环后，或者直接通过抗原从胞质至溶酶体的转移。如在mRNA结构中设计溶酶体靶向序列。通过对比蛋白质相关疫苗，通过mRNA可持续获得抗原，这在抗体广度和亲和力方面具有显著作用，从而带来更持久的保护。mRNA具有编码抗原决定簇种类和数量非常丰富的优点。mRNA能编码全长蛋白质，因此可避免病人MHC半抗原限制。同时，通过串联结构设计可以将多种抗原表型组装在一条mRNA链中。通过这个方法，BioNTech AG公司开发了个性化mRNA癌症疫苗。该疫苗可识别单个和免疫原肿瘤突变，在指定mRNA疫苗上装备这些新抗原。首个人体试验证明了该方法在晚期黑色素瘤上的临床可行性和安全性。所有免疫病人产生了针对所选抗原的CD4+T和CD8+T细胞，还有一部分病人展现出实质抗肿瘤反应。为一种特定疾病定制一种新的mRNA结构可以简单而快速的完成，使得mRNA成为诱导免疫抵抗感染性疾病的理想候选者。这些趋于快速突变的疾病需要弹性而迅速的制备合适疫苗与循环系统中病毒株相匹配。这种背景下，预防性mRNA疫苗已在I期临床试验中被认为在应对感染性疾病时安全有效，如流感和狂犬。在大、小动物模型中，mRNA疫苗能够诱导针对新发感染的免疫反应，如寨卡、埃博拉、HIV。而且，通过细胞内蛋白质原位表达，mRNA能够收获合适折叠的产物和糖基化抗原，为挑战性产物和蛋白抗原有限稳定性提供解决方案。现代治疗制备了一种编码CMV五聚体五种不同亚基的mRNA疫苗。与mRNA序列针对CMV糖蛋白gB不同，这种多抗原mRNA疫苗在免疫小鼠和非人灵长类中可诱导更强而持久的中和抗体。mRNA作为危险信号自从mRNA在疫苗学中出现以来，最初的免疫识别模型认为T细胞和B细胞对“非自我”蛋白质产生反应，同时诱导对“自我”蛋白质的耐受，这种理论是建立在克隆选择理论的基础上的，但却被认为是不够的。1989年，Charles Janeway提出抗原提呈细胞(APCs)除了提供一个适合的抗原决定簇外，还能提供一个激活淋巴细胞的第二个共刺激信号。他指出，入侵的微生物是非自我的，不是因为外源抗原的存在，而是通过胚系编码的模式识别受体(PRRs)来识别感染性或微生物成分，其被称为病原体相关的分子模式(PAMPs)。几年后，Polly Matzinger详细阐述了这个概念，并指出APC不仅对外源微生物信号作出反应，而且还会被来自受损细胞的危险或警报信号所激活，如热激蛋白和胞外核酸。支持这种传染性非自我模型和危险理论的第一个真正证据出现在1996年，Jules Hoffmann在果蝇对致病微生物的作用中提出 Toll-like 受体(TLR)的参与。有趣的是，这些TLRs在哺乳动物中，在结构和功能方面有显著的进化保守性。两年后，Beutler团队确认TLR4是识别小鼠体内细菌性脂多糖(LPS)的PRR，更加丰富了该理论。再加上Ralph Steinman在DC 生物学上的开创性工作，这些发现彻底改变了我们对免疫反应是如何产生和调节的认识。虽然人们早就知道外源mRNA诱导I型干扰素(IFN)的产生，特别是IFN-α和IFN-β，但是 mRNA内在免疫学机制仍不清楚。在2000年早期，mRNA递送被证明可以触发DCs的抗病毒活性，这涉及到通过位于内体的 TLR7和TLR 8对单链RNA的识别。通过形成二级RNA结构，或在IVT mRNA产生过程中引入双链RNA片段，可通过内体TLR3途径触发免疫激活。除了TLRs，dsRNA还可以激活胞内RNA敏感器视黄酸诱导基因I(RIG-I)和黑色素分化相关蛋白5(MDA5)。mRNA与这些危险传感器的结合通过特定的接头分子导致下游信号传递(即MyD88对TLR7/8，TRIF对TLR3)，最终产生I型干扰素和其他促炎细胞因子(如IL-6和TNF-α)。反过来，I型IFNs结合自分泌或旁分泌受体，激活Janus激酶信号传导转录活化途径(JAK-STAT)，该通路调节数百种参与抗病毒免疫的蛋白质的基因表达。因此，这些信号通路协调激活和促进不同的固有和适应性免疫反应，被称为mRNA的“自我佐剂效应”。mRNA疫苗开发的范例近几年出现很多mRNA疫苗平台。IVT mRNA的基本结构与“成熟”真核mRNA非常相似，由(i)一个蛋白编码的开放阅读框(ORF)组成，两侧分别有(ii)5’和3’非翻译区（UTRs），末端为(iii)7-甲基鸟苷5’帽结构和(iv)3’poly(A)尾。这些非编码结构特征在mRNA的药理学中起着重要作用，可以通过个体优化来调节mRNA的稳定性、翻译效率和免疫原性。2004年，kariko和他的同事观察到，体外人树突状细胞在接触不同来源的mRNA时，可以耐受哺乳动物的mRNA，而对细菌、坏死的哺乳动物细胞和IVT mRNA具有强烈的炎症细胞因子反应。有趣的是，他们发现内源性mRNA免疫调节能力的强烈降低可能是由于mRNA结构中存在修饰核苷酸，如甲基化核苷或假尿苷。因此，确定了自然发生的翻译后mRNA 核苷修饰，使得内源性mRNA免于免疫检测，这使得细胞能够区分病理性的或入侵性的 mRNA。这为mRNA的开发提供了新的机会: 通过结合修饰核苷，被称为“核苷修饰mRNA”的mRNA可减少免疫刺激活性，从而提高安全性。此外，修饰核苷使得设计mRNA疫苗稳定性和翻译能力增强，因为它们可以避免I型干扰素诱导的直接抗病毒途径，并且可以程序化降解和抑制入侵的mRNA。例如，在IVT mRNA中发现以假尿嘧啶核苷取代尿苷，可以降低2’5’寡腺苷酸合成酶的活性，该酶可以调节RNaseI切割mRNA，此外，还测定了蛋白激酶R的低活性，该酶可抑制mRNA的翻译过程。在一次治疗中，Kormann 等人，证明了核苷修饰的mRNA编码促红细胞生成素(Epo) ，其中添加25% 的硫尿嘧啶核苷和25% 的5- 甲基胞嘧啶核苷，肌肉注射2周后，免疫小鼠Epo水平是对照小鼠的5倍，相反，未修饰的 mRNA没有显著变化，只引起了实质免疫反应。除了加入修饰的核苷酸外，其他方法也被证实可以提高mRNA的翻译能力和稳定性。一个例子是开发序列设计mRNA。通过mRNA ORF和UTRs优化mRNA的表达可以增加，例如通过丰富GC成分，或者通过选择天然长存活mRNA分子的UTRs。另一种方法是设计“自我扩增mRNA”结构。其大部分来源于甲病毒，其ORF由一个感兴趣的抗原以及一个编码病毒复制酶的ORF组成。后者驱动细胞内mRNA复制，因此能显著地增加抗原表达能力。早在1995年，Johanning 等人就发现，肌肉注射来自 Sindbis 病毒的自我扩增mRNA，导致蛋白质表达水平较非扩增mRNA增加了10倍，这种蛋白质表达水平可以维持更长的时间(从2天到10天)。同时对mRNA末端结构也做了一些修改。抗逆转帽子(ARCA)修饰可以确保正确的帽子定位在5’端的方向，这意味着最完整的mRNA片段可有效结合核糖体。其他帽子修饰，比如硫代磷酸酯帽子类似物，可以进一步提高其对真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)的亲和力，增强其对mRNA脱帽复合体的抵抗力。研究发现mRNA polyA尾部的延伸与表达时间相关，3 ‘UTR的特异性修饰可以减缓脱烯化作用对polyA尾部的降解。此外，还有一些更奇特的方法被提出，比如生成能够抵抗核酸外切酶降解作用的环状RNAs。近年来，人工合成的多胺复合物与 mRNA和 eIF4E蛋白预组装后，其表达效率明显高于单独的mRNA，这可能是由于这些复合物具有较高的稳定性以及对核糖体更高的募集作用。相反地，通过改变其结构，mRNA触发先天免疫反应的效力可以进一步提高，但是会损害翻译能力。CureVac AG公司发现，通过硫代磷酸酯骨架稳定mRNA，或者通过阳离子蛋白鱼精蛋白进行沉淀，虽然抗原表达量减少，但是可以获得更强的免疫刺激能力。这促进了鱼精蛋白复合物mRNA分子的发展，使其既可以单独作为多肽和蛋白质为基础的疫苗的免疫佐剂(即RNA佐剂) ，也可以在一个由抗原编码mRNA和鱼精蛋白mRNA复合物组成的双组分mRNA平台中发挥作用，以提高疫苗的免疫原性(即RNA活性)。综合起来，将这些发现作为mRNA疫苗配方设计的原则。一种策略是使用完全优化以收获强的佐剂效应的mRNA，另一种策略是利用修饰mRNA获得高翻译能力，从而提高抗原的生物可利用性。考虑到接种目的，我们应该注意这些修饰既要有利于mRNA翻译，又要部分或完全减少mRNA分子和一个或多个病毒特异性PRRs的相互租用。因为这些可能会削弱mRNA疫苗的佐剂效果。毕竟，两种结果都受到I型IFN诱导基因的反向调节。人们通常优先考虑mRNA的翻译能力，以提高抗原的可利用性。然而，从免疫学的角度来看，先天免疫对mRNA更加敏感，其可引起表型免疫反应和细胞因子的产生，至少这同等重要。事实上，这些先天性免疫信号将触发和指导效应反应的选择，这对疫苗的治疗价值至关重要。尽管如此，这种 mRNA自我佐剂效应的效力必须与其固有的任何不良反应的风险权衡，包括炎症反应和自身免疫事件。这个挑战的关键是在mRNA疫苗的翻译能力和佐剂性能之间找到一个良好的平衡，以获得足够的，但是安全的免疫原性，这些将在后文讨论。mRNA疫苗递送体内方式第一个评估mRNA递送的人类实验使用的是体外方式，使用编码抗原mRNA转化单核来源DC，再作为细胞疫苗回输入病人体内。关于mRNA基础DC疫苗的优秀综述随处可见。近几年，热点开始指向直接给入mRNA。一般来说，体内直接将mRNA靶向APCs比体外得到DC疫苗有更多优势。首先，体外分离和培养病人特异性DC的步骤可以省略，从而降低人力物力成本。其次，体内递送mRNA更接近于自然病毒感染，有利于提高疫苗效果。多种免疫细胞和非免疫细胞在自然环境下直接转化，这样可以立即激活固有免疫，并顺次将信号传递给适应性免疫。而且，关键免疫事件，如炎症细胞因子和化学因子释放，在转染后几个小时内达到峰值，这在制备体外DC疫苗时是无法实现的。尽管mRNA疫苗原位靶向APCs方面有很多优势，但是还有很多技术难题需要克服，才能成功地将mRNA传递到目标细胞。与给药途径无关，一些被设计的进化障碍用来防止外来核酸的入侵，限制外源性 mRNA的传递。给药早期，mRNA应该能抵抗组织和血液中RNA酶的降解。由于 mRNAs 是大型多阴离子分子，它们不能被动扩散通过细胞膜，因此 mRNA分子依赖于主动的细胞内摄取机制。这意味着，即使完整的mRNAs被APCs摄取，几乎所有的mRNA分子最终都会被内含-溶酶体区域包裹并降解。此外，抗病毒宿主防御机制通过RNA免疫识别诱导，增加破坏mRNA酶活性并抑制其进一步的细胞翻译。裸露、无保护mRNA疫苗的局部递送尽管存在各种递送障碍，裸露、无保护mRNA在通过不同注射方式给药后仍能诱导蛋白表达。早期研究发现，肌肉、皮下和皮内注射在注射部位可检测到蛋白表达，从而引发获得性免疫。然而，人们却很少知道其工作机理。2007年，Probst等证明真皮体细胞，如肌肉细胞、成纤维细胞和角化细胞能够通过离子依赖方式持续摄入β-半乳糖苷酶编码mRNA。Lorenz等揭露了mRNA摄取的更多细节，其使用成纤维细胞系证明mRNA首先被scavenger受体识别，然后通过caveolae和脂筏摄取机制内化，进入胞内后，mRNA分子通过内吞途径大部分进入溶酶体，只有很少部分进入胞内。仅仅几年后，参与摄入未修饰mRNA的免疫细胞就得到确定: 小鼠体内皮肤驻扎树突状细胞能够通过大胞吞噬引入裸mRNA，并引发T细胞反应。通过RNActive（RNA活性）疫苗技术，确定了不同类型的细胞参与了mRNA疫苗的摄取。皮内注射，所有疫苗组分，包括编码 mRNA和鱼精蛋白复合mRNA，都被免疫细胞和非免疫细胞摄取，在巨噬细胞，树突状细胞和中性粒细胞中检测到频率最高。这与驻地APCs活化标志物表达的增加以及不同细胞因子和趋化因子的短暂产生相吻合，表明该制剂的自佐剂效果。除了这些局部诱导的作用，两个独立的研究分别测试RNActive或编码序列mRNA（裸mRNA），表明活化的免疫细胞迁移到淋巴结(LNs) ，能够检测到固有免疫信号以及引流淋巴结中的mRNA编码抗原。近些年来明确了注射路线对mRNA接触的细胞类型和诱发的免疫反应起着重要的作用。因此，直接将mRNA注射至淋巴结成为确保运送到APC的最佳途径。Kreiter及其同事强调了这一点，他们指出未经修饰的裸mRNA疫苗，通过淋巴结注射比通过皮肤注射诱导T细胞免疫能力提高。他们证明，在淋巴结中，裸mRNA主要由驻留DC (和巨噬细胞)通过胞吞作用摄取。此外，随着免疫细胞广泛浸润到各种肿瘤类型的认识不断增加，也促进了裸 mRNA在瘤内应用的研究。事实上，在不同小鼠皮下肿瘤模型中，肿瘤浸润CD8a + 交叉表达DCs 主要负责注射后mRNA的摄入，导致mRNA表达超过5天。值得注意的是，自我扩增mRNA情况不同。首先发现自扩增mRNA不能直接转染APCs，自扩增mRNA长度明显延长(10kb,而非扩增mRNA只有2-3kb)。尽管如此，这种不能直接转染APCs的现象，并没有在肌肉注射后终止引发CTLs。为了阐明潜在的机制，Lazzaro 等人研究了(转染)肌肉细胞和(未转染)专职APCs各自对CTL引发的贡献。他们的结论是，APCs可以吸收被转染肌肉细胞加工的抗原，交叉呈递肌细胞表达的抗原是诱导CTL反应的机制。因此，转染心肌细胞等体细胞可能会影响抗原的丰度和持续时间，而这些细胞中TLR和胞浆RNA传感器的激活可导致局部炎症和树突状细胞的浸润。为了进一步提高固有免疫活性，抗原编码mRNA与免疫激活剂（蛋白质）或免疫刺激剂（mRNA转录子）结合用来检测。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)CSF)皮内注射有助于单核细胞的浸润，有助于mRNA转染的成熟DCs向淋巴结迁移。免疫佐剂聚肌苷酸和脂多糖的共同递送可使APCs快速成熟，使细胞摄取mRNA的能力减弱。因此，这些佐剂可以降低mRNA转运中的毒性，从而使 T细胞的抗原生物可用性发生改变。另外，VanLint等通过给予编码一个抗原的4个裸 mRNA和3个额外的免疫调节分子（CD40配体、组成型活化物TLR4和CD70，申请专利TriMix mRNA技术）的混合物，注册RNA免疫疗法。TriMix技术目前正在用于治疗黑色素瘤和乳腺癌的mRNA免疫疗法临床研究，其中未经修饰的裸 mRNA序列的混合物，分别被淋巴结注入或直接注入可接触的肿瘤病变。最近，一项针对 HIV-1感染的剂量升级临床研究表明，淋巴结注入TriMix mRNA疫苗是安全和耐受的，同时在高剂量下获得中等强度的HIV特异性 T细胞反应(总mRNA剂量为1.2mg)。mRNA递送系统的发展纳米颗粒开启新通道尽管裸mRNA的研究取得了成功，但是对于纳米载体的研究已经开始。这背后的基本原理是，mRNA纳米药物可以作为多功能药物，扩大疫苗递送的选择范围。首先，由于纳米 mRNA能更好地防止酶促破坏，新的传递途径，如静脉注射成为可能。此外，通过将mRNA制成纳米颗粒，可以改变其生物分布，细胞靶向性和细胞摄取机制，从而促进mRNA和疫苗的传递。尽管目前已经清楚的知道，纳米颗粒的选择和优化是成功转染mRNA的关键。但是有必要认识到，许多研究表明，在培养细胞中的转染实验可能不能可靠地预测mRNA制剂在体内的行为。Bhosle 等人进一步证明了体外和体内 mRNA传递之间的明显差异，他们观察到体外和体内存在完全不同的细胞摄取通路，裸mRNA和脂纳米颗粒mRNA均如此。此外，使用高通量系统，Paunovska 等人能够测试数百个脂纳米颗粒（其用于静脉注射后，将核酸递送给巨噬细胞或内皮细胞），发现其体外和体内效果几乎没有相关性。这些研究提出了这样一个问题: 是否可以合理地设计出纳米颗粒基质，以充分发挥其作为mRNA疫苗增强剂的多功能作用? 在以下章节中，我们将讨论设计mRNA疫苗纳米颗粒时的一些关键考虑，特别是针对mRNA LNPs，因为这些已经进入了(早期)临床试验阶段。对于读者来说，包括但不限于，鱼精蛋白、脂质或聚合物，以及杂交制剂在内的各种不同化学特性的纳米片段的广泛总结可以在其他地方找到。用于mRNA递送的脂纳米颗粒的设计和制备经过测试用于mRNA递送的脂质形式通常由阳离子/离子化脂质和其他“辅助”脂质组成，如磷脂、胆固醇和/或聚乙二醇(PEG)。阳离子化脂质和带负电荷的mRNA分子通过静电作用形成复合物，并且可以根据氨基团的 pKa 再细分为(i)“永久带电脂质”，如 DOTMA，DOTAP和DC-胆固醇，或(ii)“ pH依赖性离子化脂质” ，如D-Lin-MC3-DMA和类脂分子 C12-200。这些可离子化的脂质(pKa < 7),最初是为 siRNA传递而优化的，在生理 pH条件下具有中性至轻度的阳离子电荷。这比永久性带电的脂质有益处，其中最重要的是可离子化的脂质与减少毒性和延长血液循环寿命有关。其他脂质成分被认为是“辅助脂质” ，因为它们具有独特的功能特性，可能影响复合mRNA LNPs的结构排列，从而提高其稳定性或促进mRNA的胞内摄取和胞浆进入。影响整体转染效率的关键障碍之一，是吞噬mRNA LNPs的内涵体降解。因此，我们努力修饰和优化mRNA LNPs，以促进内涵体到胞浆的转化。内涵体mRNA释放的机制依赖于LNP的质子化（离子化）和内涵体膜的阴性磷脂形成脂质混合物。这些脂质之间的离子对形成会引发膜融合和膜失稳，这反过来又加强了分子从内涵体逃逸。此外，这种脂质交换被认为可以诱导非双层结构转换(即层状结构转换为倒置的六方形) ，这将使LNPs解离，并使内涵体膜去稳定性。研究已经将mRNA和脂质成分的结构组织与最终的转染效率联系起来。指出 mRNA LNPs的物理化学和结构特征将取决于脂质组成，mRNA与阳离子脂质总量的比值，以及LNP的合成。将mRNA与含有永久带电脂质的单层脂质体混合制备 mRNA LNPs时，假定脂质体重排形成多层板层结构，其中mRNA分子被夹杂在同心脂质双层中。添加饱和磷脂，如DPPC和 DSPC，增加了阳离子脂质体的相变温度，并支持了这种脂双层结构的形成。相比之下，不饱和磷脂（DOPE）有助于形成非板层状脂相(即倒六角相) ，这被发现有助于内涵体逃逸。然而，后者只有在体外条件下才适用。在临床前试验中，DOPE与血清诱导的阳离子(DNA)LNPs的崩解增加有关，因此体内转染效率较低。另一种mRNA LNPs的制备方法是乙醇稀释法，这是一种适合制备含有可离子脂质的，更先进的LNPs的方法。在这里，单个脂质溶解在乙醇中，然后在酸性水溶液中与mRNA迅速混合。通过稀释乙醇相，脂质经历一个浓缩过程，形成LNPs，同时有效地包裹mRNA。然后在中和缓冲溶液中透析去除乙醇并中和pH。Kulkarni 和他的同事们最近阐明了这些离子化 LNP系统(具有不同的核酸有效载荷)的形成机理。他们提出，在酸性条件下的快速混合阶段，(“空”)小型脂质体结构和(“负载”)更大的电子密度粒子形成。接下来，在透析过程中，pH被中和，这些粒子趋于融合，最终形成LNP系统。此外，他们证明了PEG-脂成分通过在粒子表面施加排斥力，限制了进一步的融合，从而决定了最终的LNP大小。在另一项研究中，Yanez Arteta 等人指出，基于D-Lin-MC3-DMA，DSPC，胆固醇和PEG-脂的mRNA LNPs的结构重排呈现出一个无序的逆六方相，包含D-Lin-MC3-DMA，胆固醇，水和mRNA。这个核心由一个脂质单分子层包围，主要含有DSPC和DMPE-PEG2000成分，以及一小部分D-Lin-MC3-DMA和胆固醇。有趣的是，通过调整不同脂质的摩尔比，作者可以制备出不同表面特性的mRNA LNPs。他们发现有利于D-Lin-MC3-DMA脂质从内核部分分离到外表面的LNP成分，与提高转染效率相关。与此相反，表面富含DSPC的mRNA LNPs转染能力较弱(接近DSPC单层)。此外，作者认为，胆固醇的富集可能与LNP表面形成纳米晶体有关。虽然这项研究没有进一步研究，但之前的报道已经将胆固醇纳米晶体的出现与转染效率的提高联系起来。值得注意的是，台式微流体混合装置可用于通过乙醇稀释原理生产无载脂质体或mRNA LNPs，规模可扩大到临床应用或工业用途。这些微流体设备制备LNPs具有可控制，高通量优点，必然推动了新型LNPs基因传递的临床翻译。除了促进生产过程，新型脂质文库的筛选还有助于不断优化脂质组成。此外，这也支持了新的铅离子化脂质的发现，大大提高了 mRNA转染的效力和安全性。除了在LNP设计和生产上的进展，在体内转染细胞的作用模式上的创新是进一步发展的关键。虽然膜融合理论已经存在了十多年，但是LNP促进胞质递送mRNA的机制不能仅仅局限于此。最近的研究表明，mRNA LNPs的内源性转运是一个动态过程，涉及到影响胞质进入和mRNA翻译的循环通路和信号通路。例如，反式转运蛋白 Niemann-Pick 型C-1，位于晚期内溶酶体，发现负责大部分内化(si)RNA LNPs 的胞吐，因此强烈减少细胞溶出。相比之下，雷帕霉素复合物1对溶酶体膜的机械性靶向是触发递送mRNA翻译的关键。mRNA进入细胞和胞内转运机制间的关系虽然研究很少，但是同等重要。通过将 mRNA LNPs靶向到DCs 表达的选择性表面受体上，这些颗粒可能会进入细胞内的运输通路，这些通路对mRNA载物降解较少。因此，(mRNA)纳米疫苗已经靶向C型凝集素DEC-205，CLEC9A和甘露糖受体，它们也参与有利于吸收、内吞保护和交叉呈递死亡细胞抗原的途径。Fig. 5. Administration routes for mRNA vaccine delivery. Figure shows mRNA delivery options for both naked mRNA formats and nanoparticle-based strategies.mRNA LNPs的注入另一个关键参数是mRNA LNPs给药途径的选择，它将决定mRNA LNPs的有效性和安全性。重要的是，根据给药途径的不同，可能会遇到特定的细胞外屏障，从而导致特定粒子的优化。皮肤是一个非常方便的途径，它可以通过两种不同的机制导致免疫反应: 或者是通过mRNA LNPs局部转染和激活APCs，APC随后迁移到淋巴管，或者是通过淋巴系统被动地排出，从而直接将mRNA载荷传递给淋巴驻留APCs和T细胞。在一项对恒河猴的详细研究中，Liang 等人调查了肌肉或皮内注射可离子化LNP佐剂核酸修饰mRNA疫苗免疫细胞浸润、疫苗摄取、免疫激活和 mRNA翻译情况。在两种给药途径中，均可见中性粒细胞、单核细胞和不同的DC亚群快速聚集到注射部位(皮肤或肌肉)。虽然所有这些类型的细胞都能内化mRNA LNPs，但只有单核细胞和髓样DCs 的 mRNA翻译水平较高。此外，他们还能检测到成熟的，转基因的APCs 在引流淋巴结中。结合免疫反应，他们皮内注射导致皮肤DCs 的早期激活和更有效的迁移至引流淋巴结，以及注射部位抗原的长期可用性。总的来说，这导致了比肌肉注射更好的免疫原性，因为皮内注射导致了最高的抗体效价和CD4 + T细胞的激活。根据以前的报道，粒子大小是获得纳米粒子有效淋巴转运的关键因素。报告表明，200纳米以下的纳米颗粒能够进入淋巴细胞，而较大的颗粒在注射部位被截留。聚乙二醇化加速了(脂质)纳米粒子流入淋巴系统，而靶向配体如甘露糖和针对选择性DC受体的抗体可增加进入引流淋巴结的脂质体捕获。此外，研究表明，聚乙二醇化需要防止颗粒在皮肤的细胞外基质(ECM)中完全固定，这可以解释为ECM组分，如糖胺聚糖，可以抑制注射部位非聚乙二醇化淋巴液的分布和细胞摄取。为了给出一个优化的mRNA LNPs淋巴细胞转运的例子，Wang 等人产生了一个由 mRNA和磷酸钙预浓缩核心组成的纳米粒子系统，经DOPA稳定化，并由 DOTAP和 DSPE-PEG的脂质外壳包裹。这些mRNA纳米颗粒的粒径相对较小(< 50纳米) ，外表面没有带电荷，外表面聚乙二醇化程度很高。因此，这个系统被发现可以有效地进入淋巴组织，经皮内注射后4小时，就可以在引流淋巴结中检测到 mRNA的存在，从而可以直接将(几乎完整剂量的) mRNA传递给驻留的巨噬细胞和树突细胞。对于特定的癌症免疫治疗，引发抗肿瘤全身免疫反应非常重要，这使得静脉注射成为基于mRNA癌症疫苗非常有吸引力的给药途径。毫无疑问，一旦mRNA LNPs进入血液，粒子的大小，表面形态，结构构造等特征就会发生巨大的变化。事实上，(mrna)纳米粒子与生物体液的相互作用，引起内源性蛋白质和其他生物分子在特定表面的吸附，导致生物分子或蛋白质电晕的形成。这可能会降低mRNA LNPs的胶体稳定性，随之而来的是粒子的聚集和mRNA提前成熟释放。因此，利用荧光单粒子跟踪(fSPT)和荧光相关光谱(FCS)等先进的显微技术，测定未稀释生物介质中LNPs的大小、稳定性和mRNA包装率是一个很好的实践方法。也可以通过改变辅助脂质的组成来调整血清的稳定性。例如，胆固醇通常用于增加 LNPs的刚性(即降低脂膜的通透性) ，因此有助于提高LNP在血清中的稳定性和完整性。另外，聚乙二醇化的脂质被广泛用于提供“隐形效应”。这减少了总体蛋白质的吸附，提高了 LNPs 的胶体稳定性，但也阻碍了 LNP的细胞摄取和转染能力。在这里，具有较短酰基链的PEG脂质，可以提供一种有效的策略来克服这种“PEG壁垒”。这些PEG脂质逐渐扩散出LNP，从而暂时赋予LNP系统隐身性能，同时较长期、持久存在PEG脂质，可获得更高的转染效率。从另一个有利的角度来看，这种生物电晕的形成，为纳米颗粒提供了新的(表面)特性，有可能被用于靶向和/或增强传输。重要的是，在这个生物分子电晕中存在的单个蛋白质的数量和特性将取决于(“原始”)纳米颗粒的特性和它的生物学背景。一般而言，已知静脉注射的纳米粒子会与调理性血液蛋白反应，如补体片段、免疫球蛋白和纤维连接蛋白，从而促进吞噬细胞的摄取，以及纳米粒清除。最近，Vu 等人阐明了纳米颗粒是如何介导补体作用的，并发现这在一系列临床批准的脂质体中是相当普遍的。生物分子电晕的形成使自我表位暴露，自然产生的抗体可以结合。仅仅几个表面结合的免疫球蛋白分子，就足以触发补体激活。几项研究表明，自然调理过程可能被被动靶向APCs策略操纵，或者有可能将补体级联作为接种目的的危险信号。其他通过纳米粒子特殊扩散反应，引发广泛补体激活，临床表现为心肺不适。然而，最近的研究表明，这些纳米粒子介导的融合反应是由急性肺内巨噬细胞中毒引起的。聚乙二醇化策略已被用来减轻纳米粒的识别和吞噬细胞的快速清除。Schöttler等人证明了聚乙二醇化的纳米粒子避开了巨噬系统，不仅通过降低沉积在纳米粒子表面的补体片段和免疫球蛋白，而且通过一种选择性更高的凝集素的存在，这种凝集素的功能是一种强烈的去调理作用。然而，聚乙二醇化也有其局限性: 对于已有抗聚乙二醇抗体的患者，输注聚乙二醇化LNPs是逆向的，因为这可能导致更强的补体激活，以及聚乙二醇化纳米粒子的快速血液清除。因此应该事先了解病人的PEG敏感性，并促使人们研究新的“隐形”策略。应该指出的是，关于生物分子电晕形成的作用及LNPs动力学的详细研究仍然非常有限。然而，在这个领域的进一步进展可能会发现更多系统递送特异mRNA LNPs产物后生物分布和细胞特异性靶向方面的情况。例如，Akinc 等人发现，选择性地吸附在可离子化(中性)LNP上的 E型载脂蛋白质，通过受体介导的内吞作用与(si)RNA特异性递送给肝细胞有关。相比之下，由阳离子脂质和胆固醇，或DOPE组成的阳离子mRNA LNPs，被发现主要针对肺部，在那里它们转染组织驻留的树突状细胞，巨噬细胞和内皮细胞。有趣的是，通过降低脂质与 mRNA的比例，从而降低其脂质成分，kranz 等人发现 DOTMA-DOPE mRNA LNPs 携带负电荷，在脾脏中特异性靶向DCs。这些阴离子mRNA LNPs特异性靶向脾脏的发现，在参与I期黑色素瘤临床试验的患者中得到证实。虽然观察到的位点特异性靶向可能是由于LNP表面电荷，但是不能排除生物分子电晕的作用。因此，对这些不同荷电mRNA LNPs的生物分子电晕进行详细的比较，有助于进一步阐明静脉注射后观察到的器官分布和细胞靶向性变化背后的机制。正如前面所提到的，抗体或其他靶向性蛋白可以被纳入LNP系统，以支持mRNA LNPs的选择性器官处置，或促进特定(免疫)细胞类型受体介导的的吸收。举几个其他的例子，Parhiz 等人证明了离子化的mRNA LNPs与抗血管细胞粘附分子(PECAM-1)的抗体结合，促进了系统递送后肺内内皮细胞mRNA转染。Perche等制备了含有 mRNA的甘露糖化纳米粒子，该纳米粒子可以作为一种主动靶向策略来提高脾树突状细胞的转染率。关于潜在目标受体的更详细的总结和配体结合策略的技术细节，我们还建议读者参阅相关文献。值得注意的是，Dan Peer实验室最近提出了一个模块化的靶向平台，用于将(si) RNA LNPs选择性传递给体内不同的白细胞。在这里，LNP系统中脂蛋白通过非共价连接与靶抗体Fc区域结合。然而，应该注意的是，将靶向配体附加到 LNP系统复合物外层，增加了合成步骤、成本和管理障碍。此外，这种功能化的纳米粒子的靶向能力可以被内源蛋白质的沉积和纳米粒子的迁移和清除所取代。因此，利用这些靶向基因片段进行特异性 mRNA方法的潜在临床效益应该权衡成本的复杂性。mRNA自佐剂效应I型IFN对mRNA疫苗免疫原性的作用是双重的。很多研究揭示mRNA LNPs触发CTL反应强度的能力取决于I型IFN的产生。2篇文章显示静脉注射未修饰mRNA LNPs引发I型 IFN迅速和系统性产生，其可参与选择性靶向DC和巨噬细胞，以及TLR7通路的活化。基因敲除IFN-α受体1或TLR7受体小鼠实验表明由mRNA LNPs引发的系统性I型 IFN对于APCs和效应细胞的活化起到关键作用。当肺转移模式小鼠静脉注射mRNA LNPs同时腹腔注射抗IFNAR1抗体时，其抗肿瘤效果明显减弱。通过本研究组和其他实验室对比实验发现核酸修饰mRNA LNPs较未修饰mRNA LNPs翻译能力提高，但由于I型IFN产生大幅降低，从而无法成功诱发CTL反应。I型IFN对诱发效应T细胞反应具有巨大作用，而其他文章显示早期I型 IFN的产生抑制抗原编码mRNA的表达，这对mRNA疫苗的效果是相当不利的。De Beuckelaer和其同事表明B16黑色素瘤模型经皮下或皮内注射DOTAP-DOPE mRNA LNPs，其诱发CTL抗肿瘤免疫的效果在I型IFN阻断后明显增强。对于自扩增mRNA LNPs疫苗，Pepini等人报道在IFN-α/β缺失时，抗原表达明显增强，这与免疫原性和IgG抗体反应增强有关。另外，核酸修饰mRNA较未修饰mRNA高强度和持续的抗原表达与更优化的抗体反应有关。很明显，这提出了一个基本问题，如何处理mRNA疫苗的自我佐剂作用。一般来说，急性I型IFN介导天然免疫细胞和适应性免疫细胞的多向性和促炎症效应。事实上，I型 IFN信号诱导DC成熟，改善抗原的加工和呈递，增强DC迁移到丰富的T细胞区(例如，通过CCR7)。重要的是，I型IFN直接作为信号3细胞因子用于T细胞活化，促进克隆扩增，存活和CTL以及T辅助细胞的效应分化。在体液免疫中，I型IFN通过间接增强辅助性T细胞反应和对B细胞的直接免疫刺激作用，促进产生长期抗体反应。通过调节其他促炎细胞因子，I型 IFN还参与调节其他免疫细胞类型，如自然杀伤细胞(NK)反应。在持续性病毒感染过程中，我们可以从I型IFN的有害角色中学到经验教训。在这里，研究发现I型IFN通路的慢性激活导致调节性DCs 的产生以及病毒特异性B细胞的缺失和 T细胞反应的强烈削弱。在一篇观点文章中，De Beuckelaer 等人提出，mRNA疫苗I型 IFN反应对初始性T细胞有双重影响，这取决于I型IFN信号和T细胞启动的持续时间和相对时间。如果I型IFN是在T细胞识别MHC呈递的抗原后产生的，它们作为一种3型信号细胞因子刺激T细胞的激活和增殖。通过对比，在不同的时间段，APC和T细胞之间的相互作用被延迟甚至消失时，I型 IFN有完全相反的作用: 它们不是刺激T细胞，而是激活一个抗增殖和促凋亡的程序。这也许可以解释为什么由mRNA疫苗诱导的早期I型IFN反应，可能不仅限制 mRNA编码的抗原表达，甚至对T细胞反应产生有害影响。I型IFN参与调节免疫耐受，可以促进自我反应B细胞和T细胞的发育，这是一个更大的威胁。这会导致严重的自身免疫后果，比如系统性红斑狼疮和糖尿病。随着不同mRNA疫苗临床结果的首次发表，我们对它们在人类中的疗效和潜在副作用有了更多的了解。虽然病人的数量仍然有限，Pardi 等人指出，临床测试的 mRNA疫苗的一些观察到的副作用可能仍不全面，包括自身免疫性疾病的潜在风险。在一个非小细胞肺癌(NSCLC)的RNactive疫苗 I/IIa期临床试验中，经过5次皮内注射(剂量400-1600g) ，发现自身免疫的常见诊断指标升高到20%。另一项研究测试了RNactive平台用于狂犬病预防性疫苗的安全性和免疫原性，在第二次肌肉注射最高剂量640ug (1/37名患者)后一周，引起了中等程度的贝尔氏麻痹。这是暂时性的颜面神经麻痹，与自身免疫有关。I型IFN信号在有效性和安全性方面的复杂性，如何通过 mRNA疫苗的设计解决，需要进一步的研究。然而，毫无疑问，不同的 mRNA疫苗，不同的mRNA设计，不同的制备工艺和给药途径，将表现出不同的mRNA表达动力学和天然免疫激活细胞特异性。因此，这些 mRNA疫苗参数的改变，将会影响I型 IFN 信号对 mRNA疫苗结果的作用，从而决定它是好的，坏的，还是烦人的。诱导抗体反应和CTL反应需要在翻译效果和mRNA疫苗I型IFN活性方面做出权衡，这也许可以解释为什么未经修饰的mRNA疫苗更适合诱导CTL反应，而核苷修饰的 mRNA疫苗能检测出更好的抗体反应。尽管如此，可以肯定的是mRNA疫苗可以获得高滴度和持续表达的抗原，将有利于T细胞和B细胞反应的幅度和持续时间。令人兴奋的是，新的成像工具已经应用于新型mRNA传递系统的评价，这种系统在单细胞和组织水平上使mRNA药理学可视化，包括转基因报告小鼠品系的产生，如IFN-β报告小鼠和Cre 重组酶(mRNA)报告小鼠，以及高分辨率检测 mRNA的荧光成像mRNA探针的开发。为了举出一个突出的例子，Santan-gelo 实验室将荧光标记的 mRNA传递和基于近距离的检测结合起来。因此，小鼠肌肉递送裸mRNA或者LNP修饰mRNA时，他们能够同时检测细胞特异性摄取，转化和TLR7，RIG-I，MDA5通路的原位激活。这些实时跟踪mRNA活性的不同工具，将非常有助于确定不同 mRNA疫苗平台之间的差异，以及免疫途径的比较。结合免疫读数和彻底的安全性评估，这将有助于开发更有效和安全的mRNA疫苗。I型 IFN反应以外考虑到抗mRNA I型IFN反应的两面性，我们假设将mRNA疫苗的翻译和I型 IFN活性之间的联系解除，并用另一种更可控的免疫激活来代替I型 IFN反应将是有益的。这种策略为mRNA的结构优化为高翻译容量提供自由，例如，使用核苷修饰的 mRNA，同时选择一个“更聪明的”免疫佐剂: 一个不干扰 mRNA翻译过程，能提供有效但可控的免疫反应。在一项概念验证研究中，我们证明核苷修饰mRNA可以与临床批准的TLR4激动剂 MPLA共同递送，实现像未修饰的 mRNA一样的功能性 CTL反应，但却明显降低I型 IFN反应。此外，我们还优化了一个新的 mRNA LNP平台，该平台结合了核苷修饰的 mRNA和天然杀伤T(NKT)细胞配体α-半乳糖神经酰胺(mrna galsomes)的体内递送，称为mRNA Galsomes。在I型 IFN诱导LNP工艺mRNA和裸mRNA小鼠中，通过传统T细胞和NKT细胞的双重“抗原”信号，mRNA Galsomes能够诱导肿瘤内较高的抗原特异性CTLs、 NKT和 NK细胞细胞流，并且能够降低免疫抑制性骨髓细胞的存在。除了用更可控的免疫刺激来替代I型 IFN反应之外，在免疫疗法的框架内还开发了特异性的策略，避免I型 IFN反应以确保高蛋白表达，这是有益的。适应性免疫细胞重新启动的第一个替代方法，是利用直接编码不同抗体形式的mRNA，包括单克隆抗体、抗体片段或双特异性抗体来探索被动免疫。由于肝脏是系统递送后许多制剂的主要靶点，这个器官被用作mRNA编码蛋白制备和分泌的生物工厂。举两个例子，Thran 等人评估了序列设计mRNA 编码预防性或治疗性抗体LNP配方。这可以预防狂犬病毒感染、肉毒杆菌中毒和肿瘤。Stadler 等人设计了编码针对 T细胞受体相关CD3分子和肿瘤抗原的双特异性抗体的mRNA，被称为RiboMABs。这个 mRNA平台作为经典mRNA癌症疫苗的有效替代品，提供了一个能够消除小鼠肿瘤的T细胞强有力的浸润。另一种方法是直接将mRNA编码免疫调节分子递送到肿瘤部位，如细胞因子和共刺激分子。Breckpot和同事证明瘤内注射TriMix mRNA（CD40L,caTLR4和CD70）或使用编码含有IFN-β和TGF-β受体II的胞外结构域的融合因子的 mRNA，DC进行重新编程。与此相一致，Moderna Therapeutics 最近发表了一篇关于抗癌免疫治疗的文章，使用直接瘤内和LNP介导的mRNA编码的IL-23，IL-36γ，和OX40(L)配体的混合物递送。通过这些免疫调节分子的局部表达，这种策略能够打破DC免疫耐受，并激活肿瘤特异性T细胞反应。而且，Van Hoecke 等人的研究表明，通过肿瘤内电穿孔编码含有混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL) mRNA，已经确定可以将肿瘤转化成原位疫苗。事实上，MLKL的表达引起了一种免疫原性细胞死亡，称为坏死症，它促使肿瘤特异性抗原的释放和诱发抗肿瘤反应DAMP的形成。mRNA疫苗和免疫检查点组合对于mRNA治疗癌症或肿瘤疫苗来说，仅仅激活效应免疫是不够的，对于影响免疫激活的几个免疫抑制机制也应该重视。在T细胞的激活过程中，检查点分子的表达形成了一个强大的负反馈回路，使T细胞的反应保持在理想的生理范围内。总的来说，免疫系统应该能够迅速地对失控或潜在的危险做出反应，但同时也应该建立一个平衡来维持免疫的稳态。多项研究表明，mRNA癌症疫苗上调了效应T细胞检查点分子程序性死亡1(PD-1)及其配体(PD-L1)在肿瘤细胞和 APCs 上的表达。值得注意的是，PD-1/PD-L1检查点通路的上调主要由IFN-γ介导，也可由I型 IFN诱导。因此，出现了mRNA疫苗和PD-1检查点抑制剂结合治疗的机会。事实上，临床前的大量证据表明，与抗PD-1(L)、抗CTLA-4抗体等检查点抑制剂相结合，可以强化 mRNA治疗引起的 T细胞反应和抗肿瘤作用。这也在为数众多的I/IIb临床试验中进行测试，这些试验或在进行中，或在招募患者中，用以测试mRNA疫苗结合检查点抑制物治疗不同癌症适应症的效果。在单一疗法中，检查点抑制剂对高度难治性和晚期癌症患者，如转移性黑色素瘤和非小细胞肺癌(NSCLC)的疗效和耐受性令人印象深刻。然而，只有一部分病人受益于这些检查点疗法。因此，建立能够提高检查点抑制剂反应的有效联合疗法是一个需要强化研究的领域。尽管一些 mRNA癌症疫苗在获得客观的临床反应之前已经失败，但这些mRNA平台与检查点抑制剂的结合可能是一种有价值的途径(i)，确保诱导的抗肿瘤免疫的持久性和持续有效性，(ii)促成T细胞炎症肿瘤表型，使更多的患者对检查点抑制疗法适用。总结与展望从最早发表的mRNA体内递送文献开始，核酸成为了万能和充满希望的疫苗形式。本篇综述指出并分析了决定mRNA疫苗取得成功的2个关键因素。首先，应确保体内存在足够数量的mRNA胞内递送，尤其是靶向体内APCs。近几年来，mRNA在体内行为方面的大量知识空白已得到填补。包括裸mRNA递送或纳米颗粒递送，以及经过各种免疫途径的免疫。如今，使用脂纳米颗粒用于局部和系统递送mRNA已成为趋势。我们讨论了LNPs设计需完成的多指标任务，整体mRNA转染率取决于穿越胞外胞内壁垒的不同需求，然而需要采取预防措施，防止潜在的纳米粒子入侵(免疫)毒性。如果要将这些mRNA LNP应用于临床，满足药物和注册产品的要求也是至关重要的，从GMP条件下的规模生产，以及产品的质量控制，稳定性测试，以及临床前阶段在相关动物模型中良好安全性和有效性的评估。值得注意的是，FDA和EMA 第一次批准 siRNA治疗(OnpattroTM) ，利用可离子化LNP技术辅助亲本siRNA注射，这将为未来 mRNA疫苗的使用开创先河。另一个难以找到的平衡点是 mRNA编码的抗原表达和足够的免疫刺激之间的平衡。这两个参数对疫苗的研制至关重要，但它们都与 mRNA分子本身的结构特性有关。更具体地说，虽然 mRNA诱导的I型 IFN反应可能会增加mRNA疫苗的免疫原性，但它同样会干扰 mRNA编码的抗原表达，甚至可能导致有害的免疫效果。基础研究应该进一步关注如何控制 mRNA疫苗的 I型 IFN活性，这可能取决于 mRNA的工艺、给药途径、个体病人和预期的治疗应用。因此，不必须依赖于 mRNA自佐剂效应的方法正在兴起，例如用更可控的佐剂系统替代I型 IFN反应，或者使用 mRNA被动免疫接种方法。这些新策略是否比“传统的” mRNA疫苗更有益，这是一个值得进一步探讨的话题。不同的生物技术公司将 mRNA疗法应用于临床实践，这是令人兴奋的时刻。在不久的将来，针对突变衍生表位(新抗原)的 mRNA癌症疫苗可能成为其他临床领先癌症疫苗的有吸引力的替代品，例如那些由合成(长)肽和免疫佐剂组成的疫苗。在这里，可以预期的是，未来的临床试验检测(个体化)mRNA疫苗和检查点抑制剂的组合将更有机会成功，然而，这种组合疗法的安全性和优化将是另一个研究课题。对于预防感染性疾病的mRNA疫苗，(在非人灵长类动物)临床前研究表明，mRNA疫苗接种是可行的，通常具有良好的耐受性，并且可能比其他传统的疫苗方法更具优势。然而，在病人对 mRNA疫苗的反应方面，还需要更广泛的临床经验，包括更多的比较研究，以选择最适合的mRNA平台和给药途径，以及相对于其他疫苗策略，显示明确的治疗优势。总之，我们能够确定哪款mRNA疫苗在人体内能够安全、有效诱发免疫反应是从迟早的事，希望mRNA疫苗能成为新一代疫苗。参考来源：R. Verbeke, et al., Three decades of messenger RNA vaccine development, Nano Today Volume 28, October 2019, 100766