双特异性抗体及其体外生物学活性检测

2023-11-18

上市批准临床1期

01双特异性抗体研究现状早在1960年，Nisonoff等人首次描述了一种具有两个不同抗原结合位点的人造抗体分子，即双特异性抗体（Bispecific Antibody, BsAb）。随着抗体工程里程碑式进展，双特异性抗体的概念和技术创新也日渐发展。1980年代中期，T细胞重定向和接合（T cell redirection and engagement）的概念被首次提出来，直至2009年，运用该概念的首个双特异性抗体卡妥索单抗（Catumaxomab, CD3 × EpCAM）于欧盟批准上市，用于腹腔内恶性腹水的治疗。由于Fc介导的脱靶效应，卡妥索单抗产生了严重的细胞因子释放综合征和剂量依赖性肝毒性，加上生产成本高、市场表现不佳等原因，出于商业考虑最终于2017年退市。2014年，博纳吐单抗（Blinatumumab, CD3 × CD19）作为全球第二个双特异性抗体，获FDA批准，用于治疗急性B细胞淋巴细胞白血病，获得良好的临床效果，促使双特异性抗体的迅速发展。目前已有8个双特异性抗体药物获FDA批准上市。国内公司也深度参与双抗药物研发。截至2022年底，国内双抗在研药物共145个，处于临床Ⅰ期及临床前研究阶段药物占比80%以上。目前国内仅康方生物 AK104卡度尼利单抗（Cadonilimab，CTLA4 × PD-1）作为全球首款肿瘤免疫双抗，于2022年6月获NMPA批准上市，用于治疗既往接受含铂化疗治疗失败的复发或转移性宫颈癌患者。2022年11月，国家药监局药审中心发布《双特异性抗体类抗肿瘤药物临床研发技术指导原则》，其中指出，BsAb的开发，应该体现以解决单抗不能解决的问题为主要目标，以临床需求为导向的设计思路。BsAb能够介导免疫细胞对肿瘤的杀伤、增强对免疫细胞的激活、能够通过双靶点信号阻断防止耐药、具备更强肿瘤特异性、靶向性和降低毒性和能够介导更强的内吞作用，在治疗方面，双特异性抗体具有比单抗拥有更大的潜在优势。02双特异性抗体结构类型结构决定功能。不同的空间结构、抗体-受体结合的发生顺序（同时或者依特定顺序结合）、靶点结合强度会产生不同的生物学效应。需要根据靶点、作用机制及预期发挥的生物学效应，合理地设计BsAb。根据有无含Fc片段，可以将双抗分为IgG-like双特异性抗体（含Fc片段）和Non-IgG-like双特异性抗体（不含Fc片段）。IgG-like双抗包括：Quadromas、Knobs-into-holes/CrossMab、Dual-variable domains Ig（DVD-Ig）、Half-molecule exchange、κλ-bodies等类型。Non-IgG-like双抗主要基于scFv结构：Tandem scFvs（BiTE）、Dual-affinity retargeting molecules（DARTs）、Tandem diabodies（TandAbs）、也包括bi-Nanobody、Dock-and-lock（DNL）等类型。03双特异性抗体生物学作用机制虽然结构类型有所不同，双特异性抗体的生物学作用机制大致可归类如下。目前，普遍认为BsAb的作用机制主要包括桥联细胞、桥联受体及桥联因子三类。3.1 桥联细胞BsAb可以实现细胞毒活性效应细胞的重定向功能。BsAb的一个抗原结合部位与肿瘤细胞上表达的特异性抗原结合，而另一个抗原结合部位桥联并激活效应细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞等。目前在研的其中一个靶点为T细胞表面CD3靶点的双抗数量较多，主要应用于急性髓/淋巴细胞白血病（Acute Myeloid/Lymphoblastic Leukemia, AML/ALL）和淋巴瘤血液系统疾病的治疗（CD19, CD20, CD123, CD33, CD38, BCMA）。但靶外肿瘤毒性（on-target/off-tumor toxicities）、肿瘤微环境中效应细胞数量有限以及T细胞激活能力下降是目前CD3双特异性抗体在实体瘤治疗中存在的问题。卡妥索单抗与博纳吐单抗是较为典型的利用该机制的药物，其作用机制如下：1)卡妥索单抗（Catumaxomab, CD3 / EpCAM）：Triomab结构，属于三功能抗体，一个臂与肿瘤相关抗原EpCAM结合，另一个臂与T细胞上的CD3结合，Fc区优先识别辅助细胞如巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞上的CD64、CD32a、CD16受体。2)博纳吐单抗（Blinatumomab, CD3/CD19）：BiTEs（Bispecific T cell Engagers）结构，anti-CD3 scFv与anti-CD19 scFv通过一个柔性肽连接。3.2 桥联受体BsAb可以同时特异性阻断多条信号通路、蛋白或新生血管的生成，或通过桥联受体加强信号通路从而增强抗肿瘤效果，也可通过靶向介导增加抗肿瘤的特异性和安全性。主要有以下四种作用类型。1)Dual inhibitory checkpoint bsAbs，靶向双抑制性免疫检查点双抗：通过结合两个免疫抑制检查点分子，同时阻断多条抑制性信号通路。2)Co-stimulatory and inhibitory checkpoint bsAbs靶向共刺激和抑制免疫检查点双抗：通过结合激活性和抑制性的免疫检查点分子，阻断抑制性信号通路的同时，激活免疫细胞。3)Growth factors/cytokines and immunomodulatory checkpoint bsAbs，靶向生长因子/细胞因子和免疫检查点双抗：通过中和肿瘤微环境中的相关生长因子/细胞因子（如TGF-β、VEGF等），阻断生长因子/细胞因子对肿瘤的发展，并结合免疫检查点，调节免疫细胞。4)TAA and immunomodulatory checkpoint bsAbs，靶向肿瘤相关抗原和免疫检查点双抗：其中一个靶点位于肿瘤细胞表面，另一个靶点建立在刺激肿瘤浸润的、预先激活的免疫细胞，如肿瘤特异性效应T细胞。识别肿瘤细胞，并调节免疫细胞。3.3 桥联因子BsAb可以用于促进蛋白复合物和膜受体蛋白复合物的形成，提高抗体药物偶联物或激动剂抗体的活性。艾美赛珠单抗（Emicizumab，IXa/X）被设计成可以靶向桥连凝血因子IXa和凝血因子X，通过模拟替代凝血因子VIII，促进凝血酶的产生，降低血友病患者的出血率。04双特异性抗体体外活性检测在体外生物学活性检测中，可以根据具体项目的作用机制，采用合适的检测方法进行。最为基础地，可以使用ELISA或SPR法进行单靶点或双靶点的结合活性实验，结合活性方法适用于基于抗体技术的任何药物。另外，可以根据双抗的作用机制，如T细胞的活化、靶细胞的杀伤、受体激活或阻断后的细胞活性变化（如增殖、凋亡、下游信号通路磷酸化、细胞因子释放）等，设计基于细胞的生物活性实验（如报告基因法、流式细胞术等）。如果涉及Fc效应功能，可使用ADCC、ADCP、CDC等相关实验进行检测。以下以4种双特异性抗体的体外活性检测方法进行举例。1) Tebentafusp（Kimmtrak，CD3/IMCgp100）Tebentafusp(ImmTAC, Immune-mobilising monoclonal TCRs against cancer)Tebentafusp的生物学活性检测采用结合活性和细胞生物学活性两种方法进行。结合活性通过ELISA夹心法同时检测检测gp100和CD3双靶点的结合活性。细胞活性通过T细胞激活后释放的IL-2进行检测。2) 格罗菲妥单抗（Glofitamab, CD3/CD20）GlofitamabGlofitamab的生物学活性检测采用细胞生物学活性方法（报告基因法）进行。Glofitamab结合表达CD20的Z-138细胞或WIL2-S靶细胞后，激活表达CD3的Jurkat T/NFAT-RE-luc2P细胞，导致转录因子NFAT的激活，诱导荧光素酶报告基因的表达，两者呈成剂量依赖关系。3) 卡度尼利单抗（Cadonilimab，CTLA-4/PD-1）CadonilimabCadonilimab的生物学活性检测采用结合活性和细胞生物学活性（报告基因法）两种方法进行。结合活性通过ELISA或FACS分别检测各靶点结合或竞争结合活性。细胞活性使用荧光素酶报告基因法进行检测。4) 埃万妥单抗（Amivantamab，EGFR/c-MET)AmivantamabAmivantamab的生物学活性检测采用结合活性和细胞生物学活性两种方法进行。结合活性通过竞争法时间分辨荧光能量共振转移（TR-FRET）分别检测EGFR和c-MET靶点的结合活性。因为该分子设计为低岩藻糖化的IgG1双抗，具有ADCC效应，细胞活性采用ADCC报告基因法进行，Amivantamab与靶细胞表面的抗原结合后，Fc区与表达FcγRIIIa受体的Jurkat细胞结合，导致转录因子NFAT的激活，诱导荧光素酶报告基因的表达，两者呈成剂量依赖关系。05结语抗体药物的快速发展促进了双特异性抗体的发展。截至目前，已有200多个BsAb处于临床和临床前研究阶段，用于肿瘤和其他疾病的治疗。由于BsAb分子结构的复杂性，建立可重复的、反映双抗药物作用机制的生物测定方法用于双抗药物的效价测定和生物学特性表征仍具有一定的挑战性。对于双靶点药物的生物学活性检测，单靶点试验不能评价潜在的相互作用（如协同效应），双靶点生物测定更能反映作用机制，且省时高效。开发稳健高效的生物学活性检测方法对BsAb生产过程进行质量控制极为重要。虽然在BsAbs的研究和发展过程中，仍然面临着许多问题，但随着科学家们对BsAbs作用机制的研究深入及双特异性分子结构的不断优化，相信未来会有越来越多的BsAbs应用于临床治疗，惠及更多的患者。12月2日（周六） 13：30-17：00，诺唯赞联合生物制品圈将共同组织了一场以“抗体药关键质量属性分析及活性检测要点”为主题的线下沙龙活动，共同探讨抗体药关键质量研究基础和活性检测研究相关的内容。希望带给大家一些启发和帮助，共同助力抗体药行业的长久发展。1活动信息1、时间：2023年12月2日（周六）13:30-17:002、地点：上海（具体地点待定）3、参与人员：生物医药研发企业、科研院校和监管机构从业人员4、报名方式：扫描二维码或点击“阅读原文”,填报个人信息，仅限生物制药行业人员，规模在20人以内，本活动采用审核制，名额有限，最后以邮件确认为准。5、报名费用：50-100元（具体待定，含场地费用、茶歇等，报名缴费后若无法按时到场参与，报名费不予退还）2讨论话题一、抗体药关键质量研究基础1.关于抗体药质量研究，国内外有哪些重要的技术指南或规范？2.高产细胞株的筛选、细胞的检定有哪些关键考虑？3.抗体药质量分析技术主要有哪些？二、抗体药活性检测研究1、抗体药活性检测主要包含哪些？2、抗体药CMC阶段对高产细胞株的筛选要求都哪些？3、高产细胞株的筛选现常用的方法一般如何选择？测定方法的选择依据是怎样的？解决高通量的痛点，HTRF方法学是不是可以完全替换常规ELISA方法学？5、报告基因细胞株活性检测方法有何优点？有哪些应用场景？6、细胞株筛选和活性检测的方法学要求？eg特异性、稳定性、精密度、准确度；参考的标准是？7、抗体药的抗原结合活性测定一般在什么阶段？测定方法的选择依据是怎样的？HTRF方法的是否可以作为放行标准？8、关于ADCC活性分析，原代细胞方式和报告基因方式选择依据是什么？9、不同的药物类型eg：双抗、单抗、ADC、CAR-T对细胞因子检测的要求差异是怎样的？10、细胞因子不同测试阶段有哪些检测方法？常用方法CBA、MSD、ELISA、HTRF等选择的依据是什么？测试不同因子的选择依据是什么？是否会作为质控放行检项？3沙龙宗旨生物蜂：“蜂”有勤劳，传播，奉献之意。作为生物制品圈线下平台这一延伸，生物蜂旨在打造一个近距离的，高效的，中立的交流平台，为生物制品圈的技术达人创造交流空间！参考文献[1]Labrijn, A. 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