Trandolapril

在药物研发中，科学家常常需要面对一个看似简单却极具挑战的问题：如何精准地构建具有特定三维结构的分子？对于许多小分子药物和多肽药物而言，分子的空间构型就像一把钥匙的齿形。即使原子组成完全相同，只要空间排列稍有不同，分子与生物靶标的结合能力、代谢稳定性，甚至安全性都可能发生巨大变化。因此，如何高效、选择性地合成结构复杂、手性明确的分子骨架，一直是药物化学和合成化学中的核心问题。 近日，默沙东（Merck & Co., Inc.，美国和加拿大以外地区称 MSD）研究人员在 ACS Catalysis 上发表了一项研究，展示了一种利用酶催化顺序级联反应不对称合成非天然脯氨酸的新策略。研究团队将色氨酸合成酶 β 亚基（TrpB）与亚胺还原酶（IRED）结合起来，构建了一个无需分离中间体的两步生物催化平台：首先由 TrpB 催化酮类底物与氨基丙烯酸酯中间体形成 C-C 键并生成环状亚胺，随后再加入 IRED 及相应还原体系，对该环状亚胺进行立体选择性还原。通过这一顺序级联策略，研究人员可以从简单易得的原料出发，合成一系列结构复杂、手性丰富的非天然脯氨酸。 为什么是脯氨酸？ 在二十种天然氨基酸中，脯氨酸是一类十分特殊的成员。不同于大多数带有柔性侧链的氨基酸，脯氨酸的侧链会“反折”并与主链氮原子相连，形成一个五元环结构。这个环状骨架限制了分子的自由旋转，使局部结构更加刚性，也更容易维持特定的三维构象。对于药物设计而言，这一点尤为重要：过于柔软的分子往往需要付出额外的构象代价，才能调整到有利于靶标结合的形状；而脯氨酸单元则可以像“结构支架”一样，帮助分子框架预先固定在更有利的构象中。 事实上，许多已获 FDA 批准的药物都含有非天然脯氨酸结构，例如抗高血压药物 trandolapril、抗病毒药物 telaprevir 和 nirmatrelvir、用于 Rett 综合征治疗的 trofinetide，以及补体因子 D 抑制剂 danicopan 等。这些分子中的非天然脯氨酸结构各具特色。这些例子说明，脯氨酸骨架就像药物分子中的一个“立体支架”，当这个支架的环系、取代位置或手性构型发生变化时，整个分子的空间形状和刚性也会随之改变，从而影响它如何识别和结合生物靶标。因此，结构复杂、手性明确的非天然脯氨酸，已成为药物化学中极具价值的分子砌块。 Scheme 1. 非天然脯氨酸在药物分子中的应用，以及本文提出的 TrpB-IRED 酶级联合成策略。 然而，越是有用的结构，往往越难合成。对于非天然脯氨酸而言，合成挑战不仅在于构建环状骨架本身，更在于如何精准控制每一个手性中心的空间取向。随着取代基增多、环系变复杂，一个目标分子往往会对应多个可能的立体异构体；而在药物研发中，真正有用的通常只是其中构型明确的一种。传统方法常常需要从预先官能团化的脯氨酸出发，经过多步反应、保护与脱保护以及中间体分离，才能逐步搭建目标骨架。这样的路线不仅耗时，也不利于快速获得一系列结构多样的候选分子。 两种酶接力：先“成环”，再“定型” 这项研究的核心思路可以概括为：让两种酶分工合作，像流水线一样完成复杂分子的构建。第一步由 TrpB 完成。TrpB 原本是自然界中参与色氨酸生物合成的酶，但经过近年来的研究，人们发现它并不只会制造色氨酸。它可以利用丝氨酸或苏氨酸生成一个活泼的氨基丙烯酸酯中间体，再与不同的酮/醛类底物形成新的C-C键。换句话说，TrpB 在这里承担的是“搭骨架”的角色。 第二步由 IRED 完成。TrpB 反应后生成的环状亚胺中间体，其立体化学并非固定不变，而是可能在反应条件下发生构型“侵蚀”，在不同异构形式之间动态转化。IRED 则可以选择性地将其中某一构型的亚胺还原为胺，并在还原过程中将最终产物的空间构型“锁定”下来。对于某些底物而言，这一步还涉及动态动力学拆分：不同构型的环状亚胺可以相互转化，而 IRED 会优先还原其中更适合进入酶活性位点的一类构型。随着这一构型被不断消耗，其他异构体又会继续转化补充，最终使反应主要导向一个构型明确的产物，并同时确定产物中两个手性中心的空间构型。 如果把这个过程比作手工制作模型，TrpB 负责把零件拼成基本框架，IRED 负责把尚未固定的活动关节锁到正确角度。两者结合，便能从简单原料直接得到构型明确的复杂脯氨酸。 从简单原料到复杂手性砌块 研究团队首先通过生物信息学方法筛选野生型 TrpB。与其从少数已知酶中“碰运气”，作者选择从 InterPro 数据库中的 IPR006654 家族出发，构建 TrpB 相关蛋白的序列相似性网络。该家族包含超过 46,000 条非冗余 TrpS β-chain 序列，可以看作一张展示 TrpB 酶亲缘关系和潜在功能差异的“地图”。通过网络聚类和基因邻域分析，作者进一步寻找那些可能不依赖 TrpA 协同调控、能够独立发挥催化作用的 TrpB。最终，他们从不同序列簇中选取了 6 个代表性野生型 TrpB，既包括 CjTrpB、CsTrpB 和 GsTrpB 这样的独立型 TrpB，也包括 PtTrpB、DmTrpB 和 LiTrpB 这样与 TrpA 共定位的 TrpB。这样的设计使后续筛选覆盖了不同进化来源和不同基因组织方式的候选酶，也为发现具有底物宽容性的 TrpB 催化剂提供了更大的可能性。 图1. TrpB 候选酶的生物信息学筛选。（A）TrpB 相关蛋白的序列相似性网络，黄色标记为本文选取的候选酶。（B）候选 TrpB 的基因邻域分析，展示其是否以独立基因形式存在或与 TrpA 共定位。 随后，研究团队测试了这些 TrpB 与一系列酮类和醛类底物的反应活性。结果显示，多个底物都能生成可检测的产物，其中芳基酮、β-酮酯以及部分环己酮类底物表现较为突出。值得注意的是，不同 TrpB 对不同底物呈现出明显偏好，并不存在一个对所有底物都“通吃”的万能 TrpB。这一结果一方面说明 TrpB 家族具有比传统认知更广的催化潜力，另一方面也表明，通过筛选不同来源的 TrpB，甚至进一步进行蛋白质工程改造，有望为非天然氨基酸合成开发出更加丰富的酶催化工具箱。 图2. 研究团队筛选不同 TrpB 酶与多种酮/醛底物的反应活性。 在完成 TrpB 候选酶和底物组合的初步筛选后，研究团队进一步将 TrpB 反应液与不同 IRED 组合，优化两步酶级联反应的条件。实验发现，相比把两种酶同时加入同一反应体系，先让 TrpB 完成C-C键形成，再加入 IRED 进行亚胺还原，整体效果更好。这可能与两类酶对温度、pH 和有机溶剂的耐受性不同有关。 在确定通用反应条件后，研究团队将这一 TrpB-IRED 平台用于合成一系列结构多样的非天然脯氨酸，充分展示了该酶级联策略的合成潜力。以芳基酮底物为例，不同 TrpB-IRED 组合可以生成不同构型的 δ-芳基取代脯氨酸。其中，部分反应不仅表现出优异的立体选择性，还实现了从 L-丝氨酸等 L-氨基酸原料出发生成 D-脯氨酸产物的例子。这一点十分有趣，因为它说明 TrpB 形成的环状亚胺中间体并非只是简单继承原料氨基酸的构型，而是可以在后续 IRED 还原过程中被进一步“重塑”和锁定。 含氟芳基酮和丙酰苯类底物进一步展示了该平台对立体构型的调控能力。例如，不同酶组合可以分别导向 α,δ-cis 或 α,δ-trans 构型的产物；对于 γ-甲基化脯氨酸的合成，IRED 还可以利用中间体在 γ 位点的动态互变，通过动态动力学拆分选择性地建立两个手性中心。这类结果对于药物化学具有实际意义，因为氟取代、甲基取代和不同相对构型都可能显著影响分子的构象偏好和靶标结合方式。 β-酮酯底物则体现了该方法的实用性和可放大潜力。研究团队利用 CjTrpB-SrIRED 组合，以较高收率和优异非对映选择性获得目标脯氨酸产物；进一步放大到 10 mmol 规模后，还可以制备 Fmoc 保护的产物，并分离得到克级材料，同时保持优异的非对映选择性。这对于药物化学家而言尤其重要，因为早期药物发现并不总是需要公斤级生产，但往往需要快速获得几十毫克到数克量级的候选结构，用于后续偶联、活性评价和构效关系研究。更进一步，当以 L-苏氨酸为氨基酸来源时，该平台还能将官能化拓展到脯氨酸的 β 位，合成含有四个连续手性中心的高度复杂产物。 除了单环脯氨酸，该策略还可以用于构建更复杂的双环和三环骨架。以环己酮类底物为例，TrpB-IRED 级联反应能够生成 γ,δ-桥头稠合双环脯氨酸；对于 4-取代环己酮底物，反应还可以通过去对称化在远离反应中心的位置建立新的手性中心。进一步使用四氢萘酮底物时，研究团队还获得了三环脯氨酸产物。虽然部分底物目前产率仍有提升空间，但这些结果说明，该平台已经能够进入传统方法较难快速覆盖的复杂非天然脯氨酸化学空间。 图3. TrpB-IRED 酶级联反应合成多种非天然脯氨酸。多数反应在 0.25–1 mmol 规模进行，其中产物 3g 可放大至 10 mmol 规模并获得克级 Fmoc 保护产物。IY 表示分离收率。 机理研究：TrpB 如何抓住活泼的反应中间体？ 除了展示产物范围，研究团队还进一步探究了 TrpB 催化C-C键形成的可能路径。对于酮类底物而言，反应并不一定直接发生在最常见的“酮式”结构上，而可能需要先转化为更活泼的“烯醇式”结构。此前相关研究曾指出，TrpB 催化的酮不对称烷基化可能受限于酮在溶液中转化为烯醇的速度。 为了理解本文体系是否也存在类似限制，作者以丙酰苯底物为模型，利用 NMR 监测其 α 位氢信号在 D2O 缓冲液中的变化，并比较有无 CsTrpB 时的初始速率。结果显示，在缺少其他反应组分时，加入 CsTrpB 并不会明显加速酮-烯醇互变，说明 CsTrpB 本身并不直接催化这一互变过程。进一步在完整反应体系中考察亚胺形成速率后，作者提出 CsTrpB 可能通过两种路径促进C-C键形成：一种是直接捕获底物的烯醇式结构，另一种则可能涉及丝氨酸参与形成的烯胺型中间体。 这一机理分析虽然不直接对应产物的立体选择性，但为理解 TrpB 如何处理非天然酮类底物提供了重要线索。更重要的是，它指出了未来酶工程可以努力的方向：如果能够改造 TrpB 的活性位点，使其更有效地活化羰基底物或稳定关键中间体，就有望进一步提升反应速率、底物范围和合成效率。 图4. TrpB 催化C-C键形成的可能机制。 研究意义 这项工作并不只是合成了一组新的非天然脯氨酸，而是展示了一种进入复杂手性化学空间的新方式：利用酶级联反应，将简单原料快速转化为传统方法较难高效获得的立体复杂分子。 对于药物研发而言，能够探索更广阔的三维化学空间，往往意味着更多发现活性分子的机会。非天然氨基酸，尤其是非天然脯氨酸，是多肽药物、小分子药物和分子胶等领域中重要的结构单元。通过调节其环系、取代模式和手性构型，药物化学家可以更精细地改变分子的刚性、构象以及与靶标的相互作用方式。 当然，这一平台仍有进一步优化空间。部分底物目前产率有限，一些反应也受到底物溶解性、有机溶剂耐受性和酶底物适应性的影响。但这也正是生物催化的潜力所在：酶并不是固定不变的试剂，而是可以通过筛选和定向进化继续“训练”的催化剂。未来，随着酶工程和自动化筛选技术的发展，TrpB-IRED 以及更多酶催化模块有望被组合成更强大的合成平台，为新药研发提供更多过去难以获得的手性分子砌块。 总结 复杂手性分子的合成，长期以来是有机化学中的重要挑战。这项研究表明，酶催化的价值不只在于条件温和和绿色高效，更在于其对分子三维结构的精准控制。TrpB 与 IRED 的接力合作，为非天然脯氨酸的合成提供了一条简洁而富有拓展性的路径，也展现出现代合成化学正在发生的变化：未来的分子制造，或许会越来越多地依赖由酶精密驱动的“分子生产线”。 原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）： Asymmetric Synthesis of Noncanonical Prolines via a TrpB-IRED Enzymatic Cascade Wenxuan Li, Noah X. Hamlish, Rodell C. Barrientos, Mengbin Chen, Anna Fryszkowska, Yining Ji, Chey M. Jones, Andrew W. Kelly, Mikhail Y. Reibarkh, Heather Wang, Matthew S. Winston, Richard S. Ayikpoe*, Noah P. Dunham* ACS Catal., 2026, DOI: 10.1021/acscatal.6c02110 研究团队介绍 Wenxuan Li（李文轩）博士为本文共同第一作者之一，现任默沙东（Merck & Co., Inc.，美国和加拿大以外地区称MSD）Senior Scientist。她本科毕业于南开大学，随后在普林斯顿大学师从 John T. Groves 教授获得化学博士学位，博士期间主要从事新型真菌过氧合酶的生物催化开发与应用研究。博士学习期间，她曾在默沙东生物催化部门完成 2024 年暑期实习。 Noah Hamlish 博士为本文共同第一作者之一。他于加州大学伯克利分校获得博士学位，博士期间主要从事蛋白质和 RNA 定向进化方法开发。博士学习期间，他曾在默沙东生物催化部门完成 2025 年暑期实习。 Noah Dunham 博士为本文通讯作者之一，现任默沙东生物催化部门 Associate Principal Scientist。他在宾夕法尼亚州立大学师从 Marty Bollinger、Amie Boal 和 Carsten Krebs 教授，获得机理酶学方向博士学位；随后在加州理工学院 Frances Arnold 教授课题组从事博士后研究，研究方向为生物催化与蛋白质工程。 Richard Ayikpoe 博士为本文通讯作者之一，现任默沙东 Senior Scientist。他本科毕业于加纳大学，随后在丹佛大学获得天然产物生物合成方向博士学位。博士毕业后，他在伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校 Wilfred van der Donk 教授课题组从事博士后研究，研究方向包括生物信息学和 RiPP 类天然产物。 点击“阅读原文”，查看 化学 • 材料 领域所有收录期刊