Cisplatin

博晖创新：近日，公司控股孙公司博晖生物制药股份有限公司与北京百晖生物科技有限公司联合申报的冻干人用狂犬病疫苗（人二倍体细胞），获得国家药监局出具的《药物临床试验批准通知书》，同意开展临床试验。复宏汉霖：近日，公司自主研发的汉贝泰（贝伐珠单抗注射液）的生物制品许可申请（BLA）已获美国FDA受理。此次申请涉及的适应症包括转移性结直肠癌、联合卡铂和紫杉醇一线治疗不可切除的局部晚期、复发性或转移性非鳞状非小细胞肺癌、复发性成人胶质母细胞瘤、联合干扰素α治疗转移性肾细胞癌、上皮性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌，以及联合紫杉醇和顺铂或紫杉醇和拓扑替康治疗持续性、复发性或转移性宫颈癌。和誉医药：公司自主研发的新型、口服、高选择性且高效的小分子集落刺激因子1受体抑制剂贝捷迈（盐酸匹米替尼胶囊）用于腱鞘巨细胞瘤（TGCT）患者系统性治疗的新药申请（NDA）已获美国FDA正式受理。贝捷迈由和誉医药自主研发，并授权默克公司在全球商业化。2025年12月，贝捷迈获中国国家药品监督管理局批准上市，用于手术切除可能会导致功能受限或出现较严重并发症的症状性TGCT成年患者。亨迪药业：公司预计2025年归属净利润为3100万元至3900万元，同比下降57.4%至66.14%。由于主产品布洛芬原料药及部分特色原料药产品市场竞争加剧，毛利率下降。此外，现金管理利息收入因利率下降减少。金域医学：经公司财务部门初步测算，预计2025年年度归属净利润为负值，公司2025年年度经营业绩将出现亏损。主要原因是由于部分应收账款回款周期延长，导致产生较大的信用减值损失。康龙化成：公司预计2025年实现归属净利润16.14亿元至16.86亿元，比上年同期下降6%–10%。在主营业务持续向好的情形下，主要由于非经常性损益的下降，公司归属净利润相比上年同期下降6%-10%。上年同期主要由于处置PROTEOLOGIX,INC.股权影响，归属于上市公司股东的非经常性损益为68543.7万元。片仔癀：近日，公司开展的“温肺定喘颗粒治疗慢性阻塞性肺疾病稳定期（肺肾气虚兼痰瘀阻肺证）的随机、双盲、安慰剂平行对照、剂量探索、多中心Ⅱ期临床试验”完成首例受试者入组，正式进入Ⅱ期临床研究。温肺定喘颗粒是来源于临床经验方。其功能主治拟为“补肺温肾、止咳定喘、化痰祛瘀。用于肺肾气虚、痰瘀肺阻所致的肺胀，症见咳嗽，咳痰，喘息，神疲乏力，腰膝酸软，恶风，畏寒，痰白黏或呈泡沫状，舌质暗、苔白，脉沉细或细弱”。山东药玻：拟向中国国际医药卫生有限公司、山东耀新健康产业有限公司发行不超过1.99亿股A股股票，募集资金总额32.35亿元。扣除发行费用后的募集资金净额将用于补充流动资金。本次发行完成后，中国国际医药卫生有限公司将成为公司的控股股东，公司的实际控制人将变更为国药集团，最终控制人为国务院国资委。上海医药：公司下属上药康丽收到国家药品监督管理局颁发的硫酸艾沙康唑原料药的《化学原料药上市申请批准通知书》。该药物为唑类抗真菌药，由安斯泰来制药公司和巴塞利亚制药公司联合开发，于2015年在美国批准上市。上药康丽于2024年4月向国家药监局提出注册上市申请，并获受理。截至公告日，公司针对该药物已投入研发费用约512.87万元。石药集团：公司开发的化药1类新药强效醛固酮合成酶抑制剂（SYH2072片）已获美国FDA批准，可以在美国开展临床试验。该产品是一种高选择性强效醛固酮合成酶抑制剂，可有效降低血浆醛固酮水平而不影响皮质醇水平。本次和获批的临床适应症为未控制高血压和难治性高血压。沃华医药：公司预计2025年实现归属于上市公司股东的净利润8000万元-1.15亿元，比上年同期增长119.76%-215.9%。报告期内，公司全面落地“一降三增”（即降成本费用、增销售、增效率、增现金）战略方针，有效控制了成本。营销改革成果日益巩固，销售队伍更加专业、成熟，已经适应沃华心可舒片进入集采后的市场竞争态势，以价换量趋势初显。医院市场得到巩固与发展，同时依托院内市场积淀的品牌与学术优势，实现向院外市场的精准延伸与高效覆盖，构建“院内+院外”全终端协同发展格局，院外市场销售初具规模。兆科眼科：公司用于治疗儿童近视加深的硫酸阿托品滴眼液（NVK002）的注册申请已通过澳洲治疗用品管理局的初步评审，将进行进一步评核，支持性结果来自公司进行的第III期临床试验。硫酸阿托品滴眼液（NVK002）是一种用于控制儿童及青少年近视加深的试验性新型外用眼部溶液，成功解决了低浓度阿托品的不稳定性，并在全球受到知识产权保护。据灼识的资料，目前NVK002为全球用于治疗近视加深的最先进阿托品候选药物之一，目标患者涵盖3至17岁的儿童及青少年。中国生物制药：将以人民币12亿元总价全资收购杭州赫吉亚生物医药有限公司赫吉亚生物是一家专注于小干扰核酸（siRNA）创新药研发的先锋生物医药企业，以开发具备重磅临床价值的创新siRNA产品为使命，重点布局减肥代谢、心脑血管、神经系统三大慢病领域。赫吉亚已成功攻克siRNA药物在多个组织的递送技术瓶颈，实现对肝脏（单靶点/双靶点）、神经、肺部、肾脏、脂肪等多组织的精准靶向，达成单次给药即可长效沉默靶基因的效果，其显著优异的疗效、长效性、与安全性已获得临床前研究与临床试验的双重验证。

导读 背景：三阴性乳腺癌（TNBC）严重威胁患者健康，亟待探索新的治疗靶点与药物。研究表明，CCT196969可抑制黑色素瘤和结直肠癌，但其在TNBC中的作用机制尚不明确。 方法：通过体外和体内实验验证CCT196969对TNBC的抑制作用，同时结合转录组学分析、代谢组学分析、蛋白质组学等技术手段，明确CCT196969可抑制天冬酰胺合成酶（ASNS）表达及其下游mTOR信号通路，并确定视黄醇X受体α（RXRA）是调控ASNS的上游转录因子。通过荧光素酶实验和染色质免疫沉淀（CHIP）实验确定RXRA与ASNS启动子的结合位点。采用靶点捕获实验、细胞热位移实验（CETSA）、表面等离子共振技术（SPR）等方法证实组蛋白去乙酰化酶5（HDAC5）是CCT196969的关键作用靶点。通过qPCR、CHX追踪实验、MG132实验、免疫荧光及免疫共沉淀实验（CO-IP），检测HDAC5对RXRA转录及翻译后水平的调控作用，以及二者相互作用的关键结构域。借助PyMOL软件预测HDAC5与RXRA的结合位点，通过CO-IP实验检测HDAC5对RXRA乙酰化水平和泛素化水平的影响，最后采用IP实验和质谱分析技术解析HDAC5对RXRA的去乙酰化位点。 结果：本研究揭示CCT196969可通过下调ASNS表达、抑制天冬酰胺合成及下游mTORC通路来抑制TNBC。机制上，CCT196969靶向抑制HDAC5，减弱其1-291结构域与RXRA蛋白1-98结构域的相互作用，进而导致RXRA乙酰化（K410和K412位点）水平升高、泛素化水平降低。这些效应共同上调RXRA的转录及翻译后水平。最终，RXRA作为转录抑制因子和ASNS启动子区-1114/-1104区域结合，在转录水平抑制ASNS表达。 结论：本研究揭示了CCT196969通过HDAC5/RXRA/ASNS轴发挥抗TNBC作用的新机制，为TNBC治疗提供了潜在候选靶点，并为CCT196969用于TNBC患者临床治疗奠定了理论基础。 论文ID 原名：CCT196969 inhibits TNBC by targeting the HDAC5/RXRA/ASNS axis to down-regulate asparagine synthesis 译名：CCT196969通过靶向HDAC5/RXRA/ASNS轴下调天冬酰胺合成，从而抑制三阴性乳腺癌 期刊：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research IF：12.8 发表时间：2025.8 通讯作者：申莹莹、祖旭宇 通讯作者单位：南华大学附属第一医院癌症研究所 DOI：10.1186/s13046-025-03494-5 实验设计 实验结果 1. 小分子化合物CCT1969696有效抑制三阴性乳腺癌 本研究采用浓度递增的CCT196969分别处理人正常乳腺上皮组织细胞MCF-10A与三种TNBC细胞（4T1、MDA-MB-231、HCC-1806）48小时，CCK-8检测显示CCT196969对三种TNBC细胞均产生显著抑制效应，半数抑制浓度（IC50）分别为0.85μM、0.28μM和1.9μM，而MCF-10A细胞的IC50为3.4μM，高于上述三种TNBC细胞（图1A，图S1A）。细胞表型实验表明，CCT196969可显著抑制TNBC细胞的增殖（图1B-C，图S1B-C）、侵袭与迁移能力（图1D-E，图S1D-E），并适度诱导细胞凋亡（图1F-G，图S1F-G）。随后本研究开展体内实验，通过构建小鼠原位乳腺肿瘤模型观察小鼠肿瘤生长情况。测量分析发现，CCT196969处理组小鼠的肿瘤体积与重量均显著低于对照组（图1H-J），但两组小鼠体重未见显著差异（图1K）。此外，本研究通过尾静脉注射4T1-luc细胞在Balb/c小鼠中建立TNBC肺转移模型。对小鼠进行11天CCT196969处理后，采用IVIS Spectrum系统进行活体成像检测（图S2A），同时通过肺灌注法获取小鼠肺组织，经固定和HE染色后，利用显微镜进行肿瘤结节的计数。结果表明，CCT196969处理组的肺部荧光值及肺转移结节数量/面积均显著低于对照组（图S2B-D）。且两组小鼠体重未见显著差异（图2E）。这些结果提示CCT196969能在体内外安全且显著地抑制TNBC细胞的增殖与转移，是一种潜在的TNBC抑制剂。 图1 CCT196969在体外和体内显著抑制三阴性乳腺癌。A-G. 分别用不同浓度CCT196969处理4T1细胞和MDA-MB-231细胞48小时后进行以下实验：A. CCK-8实验。B-C. 克隆形成实验重复三次，统计细胞集落数量，观察CCT196969对细胞生长的影响。图B为代表结果，图C为统计图。D-E. 细胞侵袭与迁移实验，采集三次独立数据进行统计分析。图D为典型结果，图E为统计图。标尺为20微米。F-G. 细胞凋亡实验，采用Annexin V-FITC/PI双染色流式检测法，采集三次独立数据进行统计分析。图F代表典型结果，图G为统计图。H. 对照组与CCT196969组（10毫克/千克，每日一次灌胃）肿瘤组织大小对比。I. 对照组与CCT196969处理组小鼠肿瘤重量统计。J. 对照组与CCT196969处理组小鼠肿瘤生长曲线。K. 对照组与CCT196969处理组小鼠体重变化。 2. CCT196969通过下调ASNS抑制天冬酰胺合成，抑制下游mTOR信号通路，从而抑制三阴性乳腺癌 为探究CCT196969抑制TNBC的作用机制，研究人员对4T1细胞进行转录组分析，在CCT196969处理前后共筛选出2614个差异基因（1124个上调，1490个下调）（图2A）。随后对差异基因进行KEGG分析，结果显示CCT196969与“蛋白质消化吸收”及“氨基酸生物合成”通路密切相关（图2B），GSEA分析表明CEGB196969与氨基酸饥饿呈正相关（图2C）。通过靶向代谢组学检测超过160种代谢物，发现氨基酸相关代谢物显著下调，且变化最显著的前十代谢物中天冬酰胺是唯一的下调氨基酸（图2D-E）。转录组与代谢组联合分析显示，天冬酰胺和ASNS在“蛋白质消化吸收”和“氨基酸生物合成”通路中富集程度最显著（图2F-G）。由此推测CCT196969可能通过调控天冬酰胺代谢抑制TNBC。ASNS是催化天冬氨酸转化为天冬酰胺的关键酶，其表达量与天冬酰胺含量呈正相关，可能在CCT196969抑制TNBC过程中起重要作用。qPCR和蛋白质印迹证实，CCT196969在转录和蛋白水平均抑制ASNS表达（图2H-J），并降低小鼠血液中天冬酰胺水平（图2K）。研究表明，mTOR通路可促进肿瘤增殖与代谢，而天冬酰胺可通过Arf1激活mTORC1。蛋白质免疫印迹分析显示，CCT196969在4T1细胞及肿瘤组织中均能抑制mTORC1通路相关蛋白的磷酸化（p-4EBP1、p-S6K、p-S6）（图2L-M）。此外，本研究对经CCT196969处理前后的肿瘤组织进行免疫组化实验，检测ASNS、mTORC1通路及Ki67的表达。结果显示，CCT196969处理组肿瘤组织中ASNS、mTORC1通路（p-S6K、p-S6及p-4EBP1）与Ki67的表达均显著低于对照组（图S3A）。这些结果表明，CCT196969通过下调ASNS抑制天冬酰胺及其下游mTOR信号通路的合成，从而抑制TNBC的发展。 图2 CCT196969通过下调ASNS抑制天冬酰胺合成及其下游mTORC通路进而抑制TNBC。A.火山图显示2614个差异基因，其中红色标记为上调基因，绿色标记为下调基因，蓝色标记为无显著差异基因。B.KEGG富集分析显示差异最显著的20条通路。C.氨基酸饥饿反应的GSEA富集图。D.差异代谢物聚类热图。E.FC值最大的前十位代谢物雷达图。F.转录组与代谢组联合分析气泡图。G.按P值排序的共富集通路前三位。H.采用qPCR检测不同浓度CCT196969处理48小时后4T1细胞中ASNS的mRNA表达。I.Western blot分析不同浓度CCT196969处理48小时后4T1细胞中ASNS蛋白表达。J.Western blot检测对照组（N）与CCT196969处理组（T）小鼠肿瘤组织中ASNS蛋白表达。K.质谱法分析小鼠血液中天冬酰胺含量。L.Western blot分析不同浓度CCT196969处理48小时后4T1细胞中mTORC1通路蛋白表达。M.Western blot分析小鼠肿瘤组织中mTORC1通路蛋白表达。 3. CCT196969联合ASNase可更有效抑制TNBC 为验证CCT196969对TNBC的抑制作用是否通过介导天冬酰胺合成减少实现，研究人员将经CCT196969处理的4T1细胞分别培养于普通培养基与高浓度天冬酰胺培养基。结果显示，CCT196969可显著抑制细胞增殖、侵袭和迁移，但添加天冬酰胺可逆转此种抑制（图S4A-C），表明天冬酰胺减少在CCT196969抑制TNBC过程中起关键作用。目前天冬酰胺酶能有效降低循环天冬酰胺水平，已获准用于治疗急性淋巴细胞白血病。体内实验表明，CCT196969联合ASNase处理组小鼠的肿瘤体积和重量均小于单独处理组（图S4D-G），且组间小鼠体重无显著差异（图S4H）。结果表明，CCT196969联合天冬酰胺酶能更有效抑制TNBC，且未产生明显副作用。 4. CCT1969696通过升高RXRA水平介导ASNS下调 CCT196969可降低ASNS的转录及蛋白表达水平。为明确CCT196969抑制ASNS的作用机制，本研究首先用放线菌酮（CHX）处理4T1细胞，发现CCT196969并未改变ASNS蛋白的半衰期（图3A），表明该化合物不作用于ASNS的翻译后调控层面。因此本研究聚焦于CCT196969对转录因子的调控作用。蛋白质组学分析显示，经CCT196969处理后共有887种蛋白表达上调、720种蛋白表达下调（图3B-C）。结合转录组数据，本研究筛选出10个在转录水平和蛋白水平均发生同向变化的转录因子：RBPJ、POU2F1、KLF5、FOXK1、NFKB2、ERF、DNAJC2、FOXC1、AHR、RXRA（图3D）。通过hTF转录因子分析网站预测，仅有POU2F1、KLF5和RXRA可与ASNS启动子区域结合。POU2F1作为转录激活因子在多种癌症中高表达并促进肿瘤发展；KLF5同样是转录激活因子，常作为癌症治疗靶点及预后标志物；而RXRA通常作为转录抑制因子参与基因表达、信号转导和细胞衰老等过程。进一步实验表明，敲低POU2F1与KLF5并不影响ASNS表达（图3E-F），而敲低RXRA则显著提升ASNS的mRNA与蛋白表达水平（图3G-H）。使用CCT196969处理后，RXRA在蛋白和mRNA层面的表达均上调，ASNS表达出现下调（图3I-J），表明CCT196969可能通过上调RXRA来抑制ASNS。为验证该机制，本研究构建了RXRA基因敲除/敲低的稳定4T1细胞系，发现CCT196969处理后ASNS表达下调，且联合RXRA敲除/敲低可逆转ASNS表达的下调趋势，值得注意的是CCT196969对RXRA敲除后的4T1细胞中，ASNS表达无影响（图3K-L）。克隆形成、CCK-8及Transwell实验表明：相较于单独使用CCT196969，联合RXRA敲低能显著减弱对肿瘤细胞增殖、侵袭与迁移的抑制作用（图3M-O），这进一步证实CCT196969通过上调RXRA并下调ASNS来抑制TNBC的发展。 图3 CCT196969通过上调RXRA抑制ASNS表达。（A）经CCT196969处理48小时的4T1细胞继续使用放线菌酮（CHX）处理，分别于0、12、24、36小时收集蛋白。通过Western blot分析检测ASNS蛋白降解情况。（B）对照组与CCT196969处理组蛋白质组学分析统计图。（C）差异蛋白火山图。（D）蛋白质组与转录组联合分析的转录因子韦恩图。（E）POU2F1敲低后ASNS蛋白表达的Western blot分析。（F）KLF5敲低后ASNS蛋白表达的Western blot分析。（G）RXRA敲低后ASNS蛋白表达的Western blot分析。（H）qPCR检测RXRA敲低后ASNS mRNA表达。（I）CCT196969处理后RXRA与ASNS蛋白表达的Western blot分析。（J）qPCR检测CCT196969处理后RXRA与ASNS mRNA表达。（K-L）sgNC-4T1与sgRXRA-4T1细胞（K）、shNC-4T1与shRXRA-4T1细胞（L）经CCT196969处理后ASNS蛋白表达的Western blot分析。（M-O）shNC-4T1与shRXRA-4T1细胞经CCT196969处理与否进行以下实验：（M）CCK-8实验。（N）克隆形成实验。（O）Transwell实验。 5. ASNS启动子的−1114/-1104区域是RXRA调控ASNS转录的关键区域 根据TCGA数据库分析，乳腺癌组织中RXRA的表达低于正常组织，且在基底样亚型中表达最低（图S5A），提示RXRA可能在TNBC中发挥抑癌作用。相反，ASNS在乳腺癌中表达显著上调，且在基底样亚型中表达最高（图S5B）。TCGA数据进一步证实RXRA与ASNS呈负相关（图S5C）。为探索RXRA与ASNS启动子的结合位点，本研究从NCBI获取小鼠ASNS启动子序列，通过JASPAR网站预测出RXRA与ASNS启动子结合的前5个位点，随后进行突变设计（图S5D）并构建了五种突变质粒（图S5E）。双荧光素酶实验显示，shRXRA-4T1细胞中ASNS启动子活性显著高于shNC-4T1细胞（图S5F）。将ASNS野生型与突变型启动子质粒转入4T1细胞，发现−1114/-1104区域突变（mut4）后ASNS启动子活性显著降低，且CCT196969处理后活性无进一步变化（图S5G）。CHIP-qPCR证实RXRA与ASNS启动子−1114/-1104区域结合，且CCT196969处理后结合能力增强（图S5H）。 6. CCT196969 通过靶向抑制HDAC5上调RXRA，从而降低ASNS表达 通过CCT196969的靶点捕获实验和质谱分析，鉴定出其直接相互作用蛋白（图4A），其中不包括RXRA，表明CCT196969通过其他靶点间接调控RXRA。CCT196969是一种口服泛RAF抑制剂，同时靶向SRC家族激酶。其前十大直接相互作用蛋白（评分大于1500）包括RAF1、BRAF和SRC，但这些蛋白被敲低后ASNS表达未发生改变（图4B-D）。在其他前十位靶点蛋白中，仅HDAC5具有转录调控活性。HDAC5属于Ⅱ类组蛋白去乙酰化酶家族，通过使核心组蛋白（H2A、H2B、H3和H4）及非组蛋白的赖氨酸残基去乙酰化来抑制转录，是抗癌药物的潜在靶点。表面等离子共振（SPR）实验显示，CCT196969与HDAC5蛋白存在强相互作用，亲和常数为32.10nM（图S6A）。此外，CETSA实验表明CCT196969处理后HDAC5的热稳定性增强（图4E，图S6B-C），且HDAC5蛋白水平受到CCT196969抑制（图4F）。Western blot结果显示，敲低HDAC5可上调RXRA蛋白表达并下调ASNS蛋白表达（图4G，图S6D-E）。单独敲低HDAC5后，细胞增殖、侵袭和迁移能力均减弱。更重要的是，与单独使用CCT196969处理组相比，HDAC5敲低联合CCT196969处理组对TNBC的抑制效果显著降低（图4H-J）。因此可以合理推测，HDAC5是CCT196969在TNBC细胞中的直接作用靶点，且CCT196969通过靶向抑制HDAC5上调RXRA表达，从而降低ASNS的表达水平。 图4 CCT196969通过靶向抑制HDAC5上调RXRA，进而下调ASNS表达抑制TNBC。A. 将CCT196969固定于3D光学交联芯片，循环通过4T1细胞裂解液，通过LC-MS鉴定靶向蛋白，并根据Score值与相对定量进行聚类生成热图。Western blot检测BRAF敲低(B)/RAF1敲低(C)/SRC敲低(D)后ASNS蛋白表达、CCT196969处理前后HDAC5的热稳定性(E)与蛋白表达(F)、以及HDAC5敲低后RXRA和ASNS的蛋白表达(G)。H-J. 分别用CCT196969处理或未处理shNC-4T1与shHDAC5-4T1细胞并进行以下实验：H. CCK-8实验；I. 克隆形成实验；J. Transwell实验。 7. HDAC5通过泛素-蛋白酶体途径降低RXRA的转录水平并减弱其蛋白稳定性 前期研究已确认HDAC5是CCT196969抑制TNBC的关键靶点。随后本研究开始探索HDAC5与RXRA之间的调控关系。当敲低HDAC5时，qPCR检测显示RXRA mRNA表达升高而ASNS mRNA表达降低（图5A），表明HDAC5通过抑制RXRA转录从而上调ASNS mRNA水平。Western blot实验证实敲低HDAC5可上调RXRA蛋白表达（图4G及附图6D-E）。进一步实验表明，过表达HDAC5会加速RXRA蛋白降解（图5B），而敲低HDAC5则会延缓RXRA蛋白降解（图5C）。随后用MG132处理过表达HDAC5的4T1细胞，MG132是一种蛋白酶体抑制剂，可抑制细胞内蛋白酶活性并增强蛋白质稳定性。Western blot结果显示，过表达HDAC5会抑制RXRA蛋白表达，但经MG132处理后这种抑制作用减弱。由此本研究得出结论：HDAC5通过泛素-蛋白酶体途径降低了RXRA蛋白的稳定性（图5D）。 图5 HDAC5在转录水平下调RXRA表达，并通过泛素-蛋白酶体途径降低RXRA蛋白稳定性。A. 通过qPCR检测HDAC5敲低后RXRA与ASNS的mRNA表达水平。B. 过表达HDAC5后加入CHX，通过Western blot检测RXRA蛋白水平变化。C. 用CHX处理shNC-4T1与shHDAC5-4T1细胞，通过Western blot检测RXRA蛋白水平变化。D. 用MG132处理过表达HDAC5的4T1细胞，通过Western blot检测RXRA蛋白水平变化。 8. HDAC5与RXRA的相互作用 通过内源性CO-IP实验，本研究发现HDAC5与RXRA存在相互作用（图6A）。免疫荧光共定位结果同样显示HDAC5与RXRA在TNBC细胞核中共定位（图6B）。为确定结合区域，本研究构建了HDAC5和RXRA的一系列氨基酸截短蛋白（图6C-D）。CO-IP实验表明RXRA的1-98结构域和1-219结构域可与HDAC5结合，而99-467结构域无法结合（图6E）。类似地，HDAC5的1-291和1-674结构域可与RXRA结合，而675-1113和292-674结构域无法结合（图6F）。因此本研究初步判定，HDAC5通过其1-291结构域直接与RXRA的1-98结构域相互作用。随后用AlphaFold3预测HDAC5的1-291结构域与RXRA的1-98结构域的相互作用位点，并通过PYMOL进行可视化（图6G）。结果显示两者主要通过疏水力和氢键结合，这进一步证实HDAC5通过其1-291结构域直接与RXRA的1-98结构域相互作用。 图6 HDAC5与RXRA的相互作用。A. 4T1细胞中HDAC5与RXRA的共免疫沉淀实验。B. 4T1细胞中HDAC5与RXRA的免疫荧光共定位。C-D. HDAC5与RXRA的结构示意图及截断设计。E. 将全长HDAC5与RXRA截断片段共转染至293T细胞，通过共免疫沉淀检测RXRA的关键结合域。F. 将全长RXRA与HDAC5截断片段共转染至293T细胞，通过共免疫沉淀检测HDAC5的关键结合域。G. 通过分子对接模拟HDAC5与RXRA的结合模式。 9. HDAC5通过降低RXRA乙酰化水平，促进RXRA的泛素化修饰并上调下游ASNS的表达 作为一种去乙酰化酶，HDAC5可通过使RXRA启动子上的组蛋白去乙酰化来抑制RXRA转录，那么HDAC5是否也能使RXRA发生去乙酰化修饰？本研究从Uniprot数据库中获取了HDAC5的去乙酰化酶活性区域（675–1076 bp），随后截取该区域构建HDAC5截短片段（1–674 bp），并将此截短或全长HDAC5与RXRA共同转染至293T细胞。免疫沉淀实验表明，HDAC5可降低RXRA的乙酰化水平并上调ASNS表达，而当去乙酰化酶活性区域缺失时，RXRA乙酰化水平升高且ASNS表达发生逆转（图7A）。相反，敲低HDAC5会升高RXRA的乙酰化水平并下调ASNS表达（图7B），说明HDAC5通过调控RXRA的乙酰化水平影响ASNS表达。已有报道表明，乙酰化修饰可能影响泛素化修饰。本研究发现野生型HDAC5可促进RXRA泛素化，而当去乙酰化酶活性区域缺失时，RXRA泛素化水平显著降低（图7C），提示HDAC5的去乙酰化酶活性区域对其促进RXRA泛素化至关重要。为探究HDAC5对RXRA去乙酰化的关键赖氨酸位点，本研究将HDAC5-HA与RXRA-Flag质粒共转染至293T细胞（对照组仅转染RXRA-Flag质粒），48小时后进行免疫共沉淀与质谱分析（图7D）。通过进一步分析与筛选，发现相较于对照组，HDAC5-HA与RXRA-Flag共转染细胞中存在5个RXRA去乙酰化赖氨酸位点（图7E）。当这些赖氨酸突变为丙氨酸后，发现K410与K412同时突变时RXRA乙酰化水平显著降低（图7F），表明K410和K412是HDAC5调控RXRA的关键去乙酰化位点（图7G）。随后本研究在敲低/未敲低HDAC5的293T细胞中转染RXRA野生型或K410/K412突变体，通过Western blot检测RXRA泛素化水平。结果显示：在HDAC5敲低的293T细胞中，RXRA K410/K412突变体的泛素化水平较RXRA野生型组显著升高（图7H）。这表明HDAC5通过降低RXRA的乙酰化水平，进而提高RXRA的泛素化水平。 图7 HDAC5通过降低RXRA乙酰化水平，进而增强RXRA泛素化水平并促进下游基因ASNS表达。A. 将截短型HDAC5（1-674）或全长HDAC5与RXRA共转染至293T细胞，通过免疫沉淀实验检测RXRA乙酰化水平及ASNS表达水平。B. 敲低HDAC5后，采用免疫沉淀法检测RXRA乙酰化水平及ASNS表达情况。C. 将截短型HDAC5（1-674）或全长HDAC5与RXRA共转染至293T细胞，通过免疫沉淀检测RXRA泛素化水平及ASNS表达。D. 将HDAC5-HA与RXRA-Flag质粒共转染至293T细胞（对照组仅转染RXRA-Flag），48小时后提取蛋白，采用抗flag抗体富集RXRA。E. 基于免疫共沉淀与质谱分析绘制的HDAC5去乙酰化RXRA赖氨酸位点示意图。F. 在HDAC5敲低的293T细胞中转染RXRA突变型或野生型质粒，通过免疫沉淀检测RXRA乙酰化水平。G. 对照组RXRA的K410/K412位点质谱图。H. 在HDAC5敲低的293T细胞中转染RXRA突变型或野生型质粒，通过免疫沉淀检测RXRA泛素化水平。 10. HDAC5与ASNS的表达呈正相关 根据TCGA数据库分析显示，HDAC5与ASNS在mRNA水平呈显著正相关（图8A）。为验证蛋白水平的相关性，对TNBC组织芯片进行HDAC5和ASNS的免疫组化染色，发现TNBC患者癌组织中HDAC5与ASNS表达呈正相关（图8B-C），该结果与TCGA数据一致。此外，TCGA数据分析表明HDAC5表达水平与整体乳腺癌、ER阳性或HER2阳性亚型的预后无显著相关性，而在TNBC患者中，HDAC5低表达患者具有更长的总生存期和更好的预后（图8D-G），提示HDAC5可能成为TNBC的潜在治疗靶点。 图8 HDAC5与ASNS表达呈正相关。A. 通过TCGA数据库分析HDAC5与ASNS mRNA表达水平的相关性。B. 80例TNBC患者癌组织芯片中HDAC5与ASNS的免疫组化表征。C. 80例TNBC患者中HDAC5表达与ASNS表达的相关性分析。D-G. 基于TCGA数据库分析HDAC5表达水平与乳腺癌患者（D）、ER阳性乳腺癌患者（E）、HER2阳性乳腺癌患者（F）及三阴性乳腺癌患者（G）临床预后（总生存期）的关系。H. 分子机制示意图：CCT196969通过靶向HDAC5/RXRA/ASNS轴心下调天冬酰胺合成，进而抑制mTORC通路，最终抑制TNBC的增殖、侵袭与迁移能力。 讨论 三阴性乳腺癌（TNBC）作为乳腺癌的一种亚型，以雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人类表皮生长因子受体2（HER2）均不表达为特征，其预后极差。该亚型的复发率与死亡率均高于其他乳腺癌亚型，且患者无法从内分泌治疗或HER2靶向治疗中获益，尤其在确诊后的3-5年内。因此，化疗仍是TNBC非手术性治疗的标准方案。目前针对TNBC的潜在治疗策略包括针对细胞周期、DNA修复通路、雄激素受体信号通路及多种激酶的药物。小分子抑制剂CCT196969已被证实可通过靶向抑制RAS/RAF/MEK/ERK信号通路，在黑色素瘤和结直肠癌中抑制肿瘤细胞增殖、存活及转移。此外，鉴于其穿透血脑屏障的能力，该药物在治疗脑转移肿瘤方面可能具有潜在优势。然而，CCT196969对TNBC的抑制作用及其具体机制尚不明确。本研究为CCT196969的抗TNBC效应提供了有力证据。 通过CCK-8实验、克隆形成实验、Transwell实验及细胞凋亡实验，本研究证实CCT196969能有效抑制TNBC细胞的增殖、侵袭与迁移能力，并适度诱导细胞凋亡。值得注意的是，其增殖抑制效果优于包括顺铂和吉西他滨在内的多种临床治疗药物。体内实验进一步表明，CCT196969可显著抑制TNBC的生长和肺转移，提示该化合物可能是治疗TNBC的潜在抑制剂。通过比较CCT196969在三种TNBC细胞与MCF-10A细胞中的IC50值，本研究认为该化合物的体外潜在治疗窗口可能位于2μM以内。在体内研究中，每日10mg/kg的CCT196969（灌胃给药）对小鼠体重影响甚微，表明该剂量对小鼠治疗具有安全性和有效性。后续转录组学、代谢组学、Western blot及免疫组化分析显示，CCT196969可下调天冬酰胺及ASNS的mRNA与蛋白表达水平，并显著降低mTORC1通路下游靶点p-4EBP1、p-S6K和p-S6的表达。ASNS是参与天冬酰胺代谢的关键酶，在细胞内天冬酰胺的合成过程中起核心作用，而该过程对肿瘤细胞的生长与发育至关重要。细胞中ASNS的缺失可导致不同程度的肿瘤细胞凋亡、自噬及细胞周期阻滞。以天冬酰胺为作用靶点的天冬酰胺酶已被成功应用于白血病治疗。本研究发现，当向经CCT196969处理的TNBC细胞补充足量天冬酰胺时，CCT196969对TNBC细胞的抑制效应被有效逆转。此外，在小鼠模型中CCT196969与ASNase联用相较于单用ASNase表现出更强的TNBC抑制效果，且未显现明显毒副作用。因此，本研究表明CCT196969可通过下调ASNS表达来抑制TNBC，其作用机制涉及减少天冬酰胺合成及其下游mTOR信号通路的激活。 本研究的一个重要发现是，CCT196969不影响ASNS蛋白的半衰期，而是通过上调转录因子RXRA来抑制ASNS的mRNA水平。RXRA是一种视黄酸受体，通过参与视黄酸介导的基因激活来调控生物学效应。该蛋白可通过结合基因启动子中的特定序列，发挥转录抑制因子或激活因子的功能。研究表明，RXRA在正常细胞分化过程中表达上调，但在癌细胞中通常被抑制。与正常组织相比，前列腺癌组织中RXRA含量较低，这种低表达与无复发生存期缩短及放疗后远处复发风险增加呈负相关。此外，已有研究证实敲低RXRA可诱导放疗抗性，其缺失会促进小鼠白血病进展。RXRA日益被视为预防和治疗多种人类癌症的重要靶点，目前已应用于临床试验，特别是在评估急性早幼粒细胞白血病治疗方案及预防头颈部癌、宫颈癌和肺癌方面。然而，RXRA在TNBC中的作用尚不明确。TCGA数据库显示，RXRA在TNBC组织中的表达低于正常组织，且与ASNS表达呈负相关。本研究证实，RXRA作为转录抑制因子，可与ASNS启动子的−1114/-1104区域结合从而抑制ASNS表达。此外，在4T1细胞中敲低RXRA后，细胞的增殖、侵袭与迁移能力显著增强，且RXRA的缺失会明显减弱CCT196969对TNBC的抑制作用。 本研究另一重要发现是，通过靶点捕获实验、CETSA实验、SPR实验等证实，HDAC5是CCT196969在TNBC细胞中的关键直接作用靶点。组蛋白去乙酰化酶5（HDAC5）利用其去乙酰化酶活性，可去除组蛋白与非组蛋白赖氨酸残基上的乙酰基团，导致下游基因转录抑制。组蛋白去乙酰化酶的失调与癌症进展密切相关。既往研究表明，组蛋白去乙酰化酶抑制剂可通过靶向HDAC5减少肿瘤形成并诱导乳腺癌细胞内源性凋亡，该过程依赖胱天蛋白酶9/3信号通路介导的内源性凋亡通路。目前已有多种HDACi作为潜在抗肿瘤药物进入临床应用或临床试验阶段。在探究CCT196969作用靶点时，本研究发现该化合物并非通过已报道的BRAF、RAF1或SRC靶点调控ASNS表达，也不直接作用于RXRA。而在其他高分值基因（NR2E3、PPP1R15A、ALOX15、PTPN1、PARP9、HDAC5和POLB）中，HDAC5是唯一具有转录调控效应的因子。通过CETSA实验进一步证实，CCT196969可直接靶向HDAC5。该化合物通过直接靶向HDAC5上调RXRA表达，继而导致ASNS表达水平下降；且敲低HDAC5可显著削弱CCT196969对细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用。TCGA数据库和免疫组化分析均显示HDAC5与ASNS表达呈正相关；值得注意的是，HDAC5与TNBC 患者预后呈显著负相关，提示其可能成为未来TNBC治疗的潜在靶点。 然而，HDAC5对RXRA的调控机制较为复杂。组蛋白乙酰化会中和赖氨酸残端的正电荷，影响组蛋白与带负电荷的DNA骨架之间的蛋白质相互作用，从而导致染色质结构变得松弛并促进基因转录。相反，组蛋白去乙酰化会增强带正电荷的赖氨酸残端与DNA之间的相互作用，使染色质结构更紧密，从而抑制转录机制。本研究发现，HDAC5可能通过使RXRA组蛋白去乙酰化来抑制其转录水平，这一过程可能依赖于某些因子的协同调控。后续本研究将通过CO-IP和反向CHIP实验进一步探究哪些因子可招募HDAC5与RXRA组蛋白结合。在翻译后修饰层面，HDAC5通过泛素-蛋白酶体途径降低了RXRA的蛋白质稳定性。后续细胞内免疫荧光和内源性CO-IP实验证实，在TNBC细胞核中HDAC5与RXRA存在相互作用并共定位。此外，本研究根据HDAC5和RXRA的结构特征构建了一系列氨基酸截短片段，CO-IP实验和AlphaFold3软件预测表明，HDAC5的1-291结构域与RXRA的1-98结构域主要通过疏水作用力发生相互作用。在翻译后修饰层面，HDAC5通过其去乙酰化酶活性区域使RXRA（非组蛋白）发生去乙酰化，并上调下游基因ASNS的表达。研究表明，乙酰化与泛素化常竞争蛋白质上相同的赖氨酸位点，且乙酰化修饰可能影响泛素化的添加、去除或功能。本研究发现HDAC5可增强RXRA的泛素化水平，该过程同样依赖于其去乙酰化酶活性区域。通过质谱分析与免疫共沉淀实验，确定RXRA去乙酰化的关键赖氨酸位点为K410与K412。总体而言，HDAC5可通过转录抑制与翻译后修饰双重方式抑制RXRA，这进一步阐明了CCT196969抑制TNBC的具体机制。此外，HDAC5能通过直接调控蛋白的去乙酰化修饰来调节其转录活性。例如在肺腺癌中，HDAC5介导的SATB1去乙酰化同样会影响其对下游基因的转录调控活性；在胰腺癌中，HDAC5通过使转录因子GATA1发生去乙酰化，抑制其与下游基因PLA2G4A启动子区域的结合。另有研究表明，乙酰转移酶p300对RXRA的乙酰化修饰可增强其DNA结合能力，进而提升其转录活性。因此，本研究得出结论： HDAC5可能也通过使RXRA蛋白去乙酰化，从而抑制RXRA的转录活性，但这一结论仍需进一步研究证实。 结论 综上所述，HDAC5作为去乙酰化酶抑制RXRA的转录。此外，在翻译后水平上，HDAC5通过其1-291结构域直接与RXRA的1–98结构域相互作用，依赖其去乙酰化酶活性对RXRA蛋白K410和K412位点的赖氨酸残基进行去乙酰化修饰，从而增加RXRA的泛素化水平，通过泛素-蛋白酶途径降低RXRA蛋白稳定性，进而上调ASNS的表达。而小分子化合物CCT196969通过直接靶向抑制HDAC5的表达，导致RXRA表达水平升高。上调的RXRA作为转录抑制因子，通过结合ASNS启动子的− 1114/-1104区域进一步抑制ASNS的mRNA水平，减少天冬酰胺合成，最终抑制TNBC（TNBC）的增殖、侵袭和迁移（图8H）。本研究提示CCT196969可抑制TNBC，探索了该化合物的新药效功能，并发现了一个先前未被识别的、与天冬酰胺代谢相关的机制——HDAC5/RXRA/ASNS轴，为TNBC治疗提供了潜在候选靶点。此外，该研究为CCT196969用于TNBC患者的临床治疗提供了理论基础。 原文链接： https://jeccr.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13046-025-03494-5 版权声明 本文转载“代谢组metabolome”，版权属于原作者所有，文章翻译和转载为学术传播。 团队水平有限，翻译和转载难免有不恰当之处，请批评指正，多多包涵！ 往期精彩回顾： #多组学研究 #感染与免疫 #生物医药与生态环境研究 #科技资讯与学术诚信 #衰老研究Aging #人工智能与大数据 点赞！分享！转发！