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NATURE BIOTECHNOLOGY · 论文精读 · REVIEW在 2a 期临床试验中整合蛋白质组衰老时钟，支持同步评估延寿效应
Integration of proteomic aging clocks in a phase 2a clinical trial supports simultaneous geroprotective assessment
Nature Biotechnology · 2026-09-07 在线
药物 · rentosertib（TNIK 抑制剂）适应症 · 特发性肺纤维化
方法 · 六种蛋白质组衰老时钟NCT05938920
Abstract · 摘要
治疗衰老相关疾病的药物可能同时调节衰老过程本身，但标准临床试验设计无法检出这类效应。衰老时钟（aging clocks）有望填补这一空白，但表观遗传模型往往给出不一致、难以解释的结果。相比之下，蛋白质组时钟追踪生物学改变的即时执行者（immediate effectors），因而可能在提供衰老生物标志物或机制洞见方面更具优势。
在此，我们将六种蛋白质组时钟（ProtAge、OrganAgemortality、OrganAgechrono、PAC、ipfP3GPT 和 PAOPAC）应用于已发表的一项 12 周 2a 期临床试验的血清蛋白质组数据；该试验针对候选抗纤维化药物 rentosertib 治疗特发性肺纤维化（IPF）。
我们测量了各时钟之间的方差，发现六种时钟一致预测治疗组的生物学年龄更低。然而，单靠蛋白质组时钟无法解耦（deconvolute）衰老特异性效应与疾病特异性效应。我们通过通路分析间接处理了该问题：分析识别出 rentosertib 抗纤维化活性之外，衰老与代谢过程中可能存在的抗衰老转变。这项工作支持"双用途临床试验设计"这一目标，即将衰老终点整合进针对特定疾病适应症的研究中。
Key Points · 核心结论
1六种时钟一致读出降龄：54 次比较中 21 次显著（Q < 0.10），集中第 4 周，远超随机期望（置换检验 P < 0.0001）。
2实际年龄时钟更准：4 个实际年龄时钟与实际年龄 r = 0.70–0.84，校正后 RMSE < 4 年；2 个死亡率时钟相关弱但与疾病负担一致。
3给药方案反转直觉：肺功能改善最大的 60 mg QD 反而不如 30 mg BID 一致；后者被实际年龄与死亡率时钟同时检出，提示稳态暴露更重要。
4与抗纤维化效应解离：ΔFVC 对 ΔBioAge 解释方差极小（中位 R² = 0.06）；30 mg BID 显著逆转 UK Biobank 的年龄相关蛋白轨迹（r = −0.30）。
5衰老形态信号：SenMayo 在安慰剂组上调、所有治疗组反向；生长因子/营养感应通路被协同抑制。
6IGF 轴机制线索：IGFBP 调控的 IGF 转运与摄取通路下调，IGFBP-1/−4/−6/−7、IGFBPL1、CCN1 一致下降。
7提出监管框架：三步走：疾病试验中嵌入探索性衰老终点 → 非 IPF 人群重复 → 生物标志物资格认证。
Key Numbers · 关键数字速览指标数值
试验设计
12 周、随机双盲安慰剂对照、2a 期、IPF（NCT05938920）
蛋白质组子队列
42 人（43 人同意，1 人缺第 12 周样本被排除）；平均 67.1 岁
检测蛋白数
2,841 个（Olink Explore 3072）
六种蛋白质组时钟
ProtAge、OrganAgechrono、ipfP3GPT、PAOPAC（实际年龄）＋ PAC、OrganAgemortality（死亡风险）
比较次数 / 显著数
每方案 54 次；共 21 次显著（Q < 0.10），集中于第 4 周
实际年龄时钟表现
Spearman r = 0.70–0.84；校正后 RMSE < 4 年
受治疗影响蛋白
326 个（Q < 0.10）；安慰剂组仅 2 个
UK Biobank 对照
55,319 人；758 个年龄相关蛋白；富集 1.74 倍（P < 0.001）
60 mg QD 第 4 周 ΔBioAge
−2.71 至 −3.46 岁（全部 4 个实际年龄时钟显著）
动脉器官时钟 ΔBioAge
−6.95 至 −16.57 岁（所有治疗组、所有时间点）
Section Notes · 分节总结
第 1 节 背景与动机 · Introduction
·疾病与衰老重叠：衰老相关疾病的治疗靶点大量与衰老调控因子重叠；药物重定位提示一种药可影响多种衰老相关疾病。
·方法学问题：如何用临床试验数据测量干预对生物学衰老的效应？
·表观遗传时钟的局限：读数不一致、跨模型一致性差、难以解释、机制洞见间接。
·蛋白质组时钟的机会：蛋白是生物学过程的即时执行者，既评估年龄又便于机制归因。
·本研究：把 6 种蛋白质组时钟头对头应用于 rentosertib（TNIK 抑制剂）IPF 2a 期试验的血清蛋白质组。
第 2 节 试验设计与队列 · Trial design
·设计：随机、双盲、安慰剂对照、多剂量 2a 期；中国 21–22 个中心；12 周。
·分组：30 mg QD、30 mg BID、60 mg QD、安慰剂；筛查 128 人、入组 71 人。
·蛋白质组子研究：43 人同意、1 人排除，最终 42 人；Olink Explore 3072 测得 2,841 个蛋白。
第 3 节 衰老时钟表现 · Aging clock performance
·实际年龄时钟：4 个时钟与实际年龄强相关（r = 0.70–0.84），校正后 RMSE < 4 岁。
·死亡率时钟：与实际年龄相关弱（r = 0.16–0.23），预测年龄系统性偏高（捕捉疾病负担）。
·偏差结构：实际年龄时钟为可校正恒定偏差；死亡率时钟为无法用 OLS 校正的比例偏差。
第 4 节 治疗引起的衰老时钟变化 · Predictions
·一致下降：所有时钟均显示治疗组相对基线生物学年龄下降，安慰剂组几乎不变或略升。
·峰值在第 4 周：21/54 次比较显著，其中第 4 周 11/18；置换检验证明远超随机。
·方案差异：30 mg BID 最一致（9 次）；60 mg QD 由实际年龄时钟检出但死亡率时钟无反应。
·平台期：第 4 周后信号减弱，但第 4 周与第 12 周对比无显著差异，故称为「平台期」而非消退。
第 5 节 蛋白质组轨迹 · Proteomic trajectories
·影响范围：326 个蛋白轨迹显著改变；237 个为方案特异；89 个跨组一致（核心通路）。
·代表蛋白：下调：COL1A1、MMP10、FAP、PDGFB；相反方向：NAMPT、SOD2、ALDH1A1。
第 6 节 效应稳定性与悖论 · Stability
·并非瞬时：有效剂量组仅 5–9% 变化为瞬时；衰老时钟所用蛋白中持续变化比例更高（OR 4.65 / 2.19）。
·悖论：衰老相关蛋白持续受调节，但时钟信号却进入平台期。
·关键贡献者：LTBP2（TGF-β 纤维化主调控因子）是唯一出现在全部六种时钟中的重要特征；其余涉炎性衰老、神经退行、生殖衰老、细胞衰老与 ECM。
第 7 节 分离延寿效应 · Isolation
·与疗效解离：FVC 改善最大的组，衰老时钟一致性反而较低；ΔFVC 对 ΔBioAge 解释方差极小（中位 R² = 0.06）。
·与正常衰老对照：UK Biobank 中 rentosertib 调节蛋白富集 1.74 倍；30 mg BID 显著负相关（逆转衰老方向），60 mg QD 无相关，安慰剂与衰老同向。
·通路分化：30 mg BID 独有：代谢通路（磷酸戊糖、谷胱甘肽、胆固醇）；60 mg QD 独有：Wnt 与免疫。
第 8 节 衰老形态效应 · Senomorphic effect
·SenMayo：安慰剂组显著上调（NES = 1.48），所有治疗组反向；7 个蛋白（EREG、ESM1、IGFBP4、ITGA2、MMP10、MMP13、SPP1）出现在每个治疗组前沿。
·生长因子/营养感应通路：RTK–PLCG–ITPR、MAPK、RAS、ERK、PI3K–Akt：安慰剂上调、治疗组下调——与热量限制/雷帕霉素靶点一致。
·JAK–STAT：仅 30 mg BID 未显著上调该炎症轴，或可解释其更一致的衰老时钟反应。
·IGF 轴：IGFBP 调控的 IGF 转运与摄取通路下调；IGFBP-1/−4/−6/−7、IGFBPL1、CCN1 在所有治疗组显著下降。
第 9 节 讨论与框架 · Discussion
·结论：多时钟一致信号反对时钟特异性伪影；但不能完全排除抗纤维化活性贡献。
·监管三步框架：① 疾病试验中把衰老标志物作为探索性终点并探索给药方案 → ② 在非 IPF 人群重复 → ③ 推进生物标志物资格认证/复合终点。
·给药启示：低剂量但更频繁（30 mg BID）优于高剂量一次（60 mg QD）；平台期提示间歇给药可能更优。
·局限：样本小、周期短、以计算为主、蛋白覆盖有限、平台不含 TNIK 本身、人群单一（亚洲）。
Key Terms · 关键术语术语要点
衰老时钟
用组学数据估计生物学年龄或衰老速度的模型
蛋白质组时钟
基于血浆/血清蛋白表达训练的生物年龄预测模型
ΔBioAge
相对基线的预测生物学年龄变化量
延寿 / 抗衰老（geroprotective）
延缓、阻止或逆转衰老过程的作用
衰老形态剂（senomorphic）
抑制衰老细胞有害表型（如 SASP）但不清除衰老细胞的药物
SenMayo / CellAge
衰老与 SASP 相关基因集；CellAgeup/down 分别为促/抑衰老基因集
LMEM
线性混合效应模型，用于重复测量纵向数据分析
GSEA / NES
基因集富集分析 / 归一化富集分数
Olink NPX
Olink 平台的归一化蛋白表达值（本研究 2,841 个蛋白）
TNIK
TRAF2 和 NCK 相互作用激酶，rentosertib 的靶点
IPF / FVC
特发性肺纤维化 / 用力肺活量（疾病疗效终点）
TAME 试验
用二甲双胍检验年龄相关疾病复合终点的著名试验概念
Outreach · 大白话版
这个故事讲的是：一款治肺纤维化的新药，可能在治病的同时让身体「变年轻」了。
什么叫衰老时钟？ 抽一管血，测其中几千种蛋白，用算法算出「你的身体相当于多少岁」。就像用体检数据给身体估个「功能年龄」。这项研究一次用了 6 种不同的算法——如果 6 把尺子量出同一个结果，那就比只有一把尺子可信得多。
结果呢？ 吃了 12 周药的人，6 把尺子都显示「变年轻了」，其中第 4 周最明显；吃安慰剂的人没什么变化，甚至略微「变老」。这些受试者都是肺纤维化患者——一种和衰老高度绑定的病。
最反直觉的一点： 肺功能改善最大的那组（60 mg 每天一次），「变年轻」的信号反而不最一致；真正一致的是 30 mg 每天两次——剂量更低、但一天里药效更平稳。这提示：对衰老这件事，「细水长流」可能比「猛药冲击」更好。
怎么知道不是「病好了顺带显得年轻」？ 研究者做了三件事：① 看肺功能改善和降龄幅度是否同步——结果并不同步；② 拿 5 万多名英国人的正常衰老数据比对——用药后变化的蛋白，方向和「正常变老」相反；③ 看衰老相关特征——安慰剂组在「变老」，用药组在「抗老」。但作者也坦白：这仍是间接证据，不能 100% 排除「抗纤维化的副作用」。
为什么值得关注？ 以往抗衰老药研究，都是在药上市几十年后才回头补做（如二甲双胍、雷帕霉素）。这项研究主张：从新药研发第一天起，就把衰老指标塞进疾病试验里一起测。这样也许能提前几十年发现一个药的抗衰老潜力。
一句话记住全文： 6 把「血液年龄尺」在同一场肺纤维化药物试验里都读出了「变年轻」，而且低剂量分两次给药信号最强——这为「一个药同时治病和抗老」的双用途试验设计提供了早期证据。
Concept Cards · 概念卡片
01蛋白质组衰老时钟
用血清蛋白表达预测生物学年龄。相比 DNA 甲基化时钟，蛋白是「即时执行者」，更易解释、可直接做通路归因。
02ΔBioAge
相对基线的预测生物学年龄变化量，本研究的核心读数。治疗组下降、安慰剂组几乎不变。
03多时钟共识
6 种方法学迥异的时钟（经典机器学习 + 深度学习；年龄训练 + 死亡率训练）给出同向信号，用于排除单一时钟伪影。
04第 4 周峰值与平台期
效应急速出现后进入平台：可能反映药效学适应、新稳态，或 12 周窗口的局限。
05剂量方案的「质」差异
60 mg QD 走 Wnt/免疫（抗纤维化为主）；30 mg BID 走代谢与 IGF 轴（更像抗衰老），总日剂量相同、机制画像不同。
06衰老形态（senomorphic）效应
SenMayo 特征被压低、CellAge_down 被抬高——抑制衰老细胞的有害表型，而非直接清除衰老细胞。
07双用途试验设计
把衰老终点作为探索性生物标志物前瞻性嵌入疾病药物试验，实现「一试验、两目标」。
08仍在「早期证据」阶段
样本小、周期短、以计算为主；作者明确呼吁非 IPF 人群验证与直接实验证据。
Full Translation · 全文翻译
正文（Main）
数十年来，在鉴定衰老机制及可调控这些机制的治疗靶点方面取得的进展，已揭示出衰老与疾病核心调控因子之间存在巨大重叠。因此，近期开发治疗衰老相关疾病疗法的努力，常把衰老调控因子识别为有前景的疾病靶点1–3。药物重定位（drug repurposing）研究凸显出：由于共同的通路失调在衰老标志（hallmarks of aging）上汇聚，为某一衰老相关疾病开发的疗法，有可能调节其他衰老相关疾病乃至寿命1,4–7。衰老领域如今在把生物学洞见转化为可操作临床结果方面，面临一个关键的方法学问题：如何最好地利用临床试验中收集的数据，测量干预对生物学衰老的影响。
2013 年出现的基于 DNA 甲基化的表观遗传时钟，使量化生物学衰老的首次尝试成为可能8–10。然而，临床试验读数不一致11、跨模型一致性差12,13、可解释性面临挑战14，以及其机制洞见本身有限且间接（难以揭示驱动衰老的生物学过程），都限制了表观遗传时钟的实用性11,15。蛋白质组衰老时钟近期作为改善衰老相关疾病试验设计的潜在方案而出现16,17。与表观遗传标记不同，蛋白质是生物学过程的即时执行者，这可能使蛋白质组在评估生物学年龄以及通过通路分析进行机制刻画两方面都更有用。
2023 年 UK Biobank 蛋白质组数据集的发布，启动了若干蛋白质组时钟的开发；但因其新颖性，大多数时钟在临床场景中的验证都很少18。在一项纳入 26 名男性的 12 周监督性运动试验中，ProtAge 时钟检测到生物学年龄减少 10 个月，这一效应由 204 个蛋白中的一小部分驱动，这些蛋白主要参与 PI3K–Akt 和 MAPK 信号16,19。在近期一项为期 40 个月的恒河猴二甲双胍多组学研究（含多组学 profiling）中，一个专用蛋白质组时钟被用于展示多组织衰老减速20。一些人源年轻化干预研究，如血浆置换，将蛋白质组 profiling 作为辅助手段，服务于以表观遗传时钟为主的衰老强度评估13。
在此，我们在上述研究基础上，对六种蛋白质组时钟进行头对头（head-to-head）比较，应用于 rentosertib——一种由人工智能（AI）设计的 TRAF2 和 NCK 相互作用激酶（TNIK）抑制剂21,22——的对照 2a 期临床试验血清蛋白质组数据。我们开发 rentosertib（曾用名 INS018_055），旨在同时靶向衰老与特发性肺纤维化（IPF）21,23–28。IPF 与众多衰老标志高度共线6,29–33，这使其成为 TNIK 抑制的优先适应症；TNIK 最初被鉴定为一个参与六种衰老标志的基因4。我们从一开始就试图围绕衰老生物学来构建这一药物开发项目，塑造靶点选择、临床前验证、适应症选择与试验设计，同时遵守监管要求（图 1a）。在 2a 期试验中，我们通过纵向血清蛋白质组筛查并随后进行蛋白质组时钟分析，把衰老生物学纳入进来34。该蛋白质组 profiling 构成了一个罕见且难以获得的人体数据集，涉及一项具有衰老调节潜力的干预。
图 1：将蛋白质组时钟整合进试验设计。
在收集到蛋白质组数据后，要有效利用它，就需要在蛋白质组时钟分析与临床数据整合方面进行创新。我们选择了六种近期开发的蛋白质组衰老时钟：ProtAge16、分别以死亡率和年龄训练的 OrganAge35、PAC36、ipfP3GPT37 和 PAOPAC38。这些时钟在试验完成时已可用，代表了多种方法学与特征模型：有的训练用于预测实际年龄（ProtAge、OrganAgechrono、ipfP3GPT、PAOPAC），有的训练用于预测死亡风险（PAC、OrganAgemortality）；使用经典机器学习技术（OrganAge、PAOPAC、PAC）和深度学习（ProtAge、ipfP3GPT）训练，且基于数量各异的特征。因此，它们代表了看待人类衰老的不同视角；若它们一致，则说明所指示的生物学信号比任何单一钟都更强。这些模型被应用于所有同意参加该项辅助分析、且在全部四个时间点都提供了生物样本的 2a 期受试者。
我们评估了上述蛋白质组模型之间的方差程度，发现按实际年龄训练的时钟在追踪衰老速率调节方面比按死亡率训练的时钟更准确。尽管存在这种方差，所有时钟都显示 rentosertib 治疗后衰老速度出现统计学显著下降。在这种情形下，这一下降在多大程度上可归因于衰老生物学的调节、而非 rentosertib 的抗纤维化活性，是一个核心挑战。我们部分地通过对待治疗影响蛋白进行通路富集分析，并与外部衰老队列数据比较，来处理这一问题。在 IPF 队列内无法完全解耦这两个信号，需要在健康志愿者中验证该药物或其底层机制；尽管如此，我们的分析给出了可解释的衰老相关生物学特征，值得进一步研究。这项工作揭示了把蛋白质组时钟整合进临床试验设计的方向，以实现"让以疾病为重点的研究能够同步评估衰老调节效应"这一目标。
结果（Results）
试验与队列概况
rentosertib 治疗 IPF 的 2a 期试验（NCT05938920）是一项随机、双盲、安慰剂对照试验，于 2023–2024 年在中国 21 个中心开展，招募年龄大于 40 岁、确诊 IPF 且病情稳定的男性和女性患者。在筛查的 128 名患者中，71 人被选入接受 rentosertib 30 mg 每日一次（QD，N = 18）、30 mg 每日两次（BID，N = 18）、60 mg QD（N = 18）或安慰剂（N = 17）。至试验结束，16 名患者中止治疗。按方案，在试验开始与结束（12 周）时记录肺用力肺活量（FVC）。在试验开始与结束时、以及开始后第 2 周和第 4 周采集受试者血样。共 43 名受试者同意接受血清蛋白质组筛查，其中 1 人因试验结束时缺少一次测量而被排除。
最终队列由 42 名亚洲人组成，平均年龄 67.1 岁。本文所研究队列的完整汇总统计见补充表 1。
衰老时钟表现（Aging clock performance）
我们在 2a 期 IPF 试验 42 名受试者的基线血清样本上评估了六种已发表的蛋白质组衰老时钟：Argentieri 2024、Kuo 2024、Han 2026、Galkin 2025，以及 Goeminne 2025 的两个变体（一个训练预测实际年龄，一个按死亡风险训练）16,35–38。四个实际年龄时钟（OrganAgechrono、ProtAge、ipfP3GPT、PAOPAC）与实际年龄相关性良好（Spearman r ∈ 0.70–0.84），在最小二乘（OLS）校正系统性偏移后，均方根误差低于 4 岁（图 2a）。两个基于死亡率的时钟（PAC、OrganAgemortality）与实际年龄的相关性较弱（r ∈ 0.16–0.23），这与其训练目标和本队列的高疾病负担一致——死亡率训练模型预期会把疾病负担捕捉为升高的生物学年龄，而与日历年龄无关29,39。Bland–Altman 分析确认，实际年龄时钟带有可校正的恒定偏差，而死亡率时钟表现出比例偏差，会高估较年轻受试者的年龄，且无法通过 OLS 校正（扩展数据图 1）。时钟间相关性进一步反映了这种方法学鸿沟：实际年龄时钟彼此高度一致（r ∈ 0.78–0.89），而它们与死亡率时钟的相关性则显著更低（r ∈ 0.25–0.61；图 2b）。
图 2：由六种蛋白质组衰老时钟预测的试验受试者生物学年龄。
尽管在校准和训练目标上存在差异，六种时钟在后续分析中都检测到 rentosertib 治疗引起的蛋白质组变化，提示该药可能调节生物学衰老的互补维度。所有时间点的匿名预测结果见补充表 2。
rentosertib 引起的衰老时钟预测（Rentosertib-induced aging clock predictions）
在全部六种时钟中，与基线相比，治疗组一致显示生物学年龄下降，而安慰剂组在 12 周内变化极小或略有上升（图 3a 与补充表 3）。我们把这些变化量化为相对基线的预测生物学年龄变化（ΔBioAge），并在第 2、4、12 周将每个治疗组与安慰剂比较，每个治疗组得到 54 次比较（6 种时钟 × 3 个时间点 × 3 个方案）。在这 54 次比较中，21 次达到统计学显著（Q < 0.10），且集中于第 4 周：在该时间点 18 次比较中有 11 次显示治疗组 ΔBioAge 显著更低（图 3b 与补充表 4、5）。采用患者层面标签置换的置换检验确认，21 次显著比较远超随机期望（零分布均值 = 0.15；扩展数据图 2）。剔除 6 名发生较高级别不良事件的受试者后，类似结果仍然存在。在三个方案中，30 mg BID 产生最一致的信号（9 次显著比较），其次为 60 mg QD（7 次）和 30 mg QD（5 次）。
图 3：rentosertib 在若干方案中降低预测生物学年龄。
我们还检验了基线体质指数（BMI）是否与生物学年龄变化幅度相关，理由是固定给药可能导致体重更高患者的有效暴露更低。在每个治疗组内、对全部六种时钟计算 BMI 与 ΔBioAge 的 Spearman 相关，共 54 次检验。仅 3 次检验达到名义显著（P < 0.05），多重检验校正后无一保留（所有 Q > 0.25），确认在所研究的范围内，观察到的生物学年龄下降并未受 BMI 调节。
到第 12 周，显著比较数量减少，提示最初的蛋白质组反应出现部分衰减。对第 4 周与第 12 周年龄预测的直接比较表明，"平台期（plateau）"可能是更合适的说法，因为没有任何"方案–时钟"组合显示预测年龄的显著变化（配对 Wilcoxon 检验，P < 0.05）。
两类时钟（按实际年龄训练与按死亡率训练）对给药方案的反应不同（图 3a,b）。在原始试验报告中 FVC 改善最大的 60 mg QD 组，第 4 周在全部四种实际年龄时钟上都产生显著的生物学年龄下降（ΔBioAge ∈ −2.71 至 −3.46 岁，Q < 0.10），但两种死亡率时钟均无显著变化。相比之下，30 mg BID 方案被实际年龄时钟和死亡率时钟同时检出，使其成为跨时钟一致性最广的组别。
标准化效应量分析确认，第 4 周是衰老时钟共识度最高的时间点：30 mg BID 方案在六种时钟中的五种上显示一致的效应量（扩展数据图 3）。与等量总日剂量一次性给药（60 mg QD）相比，30 mg BID 组的每日两次给药似乎增强了与衰老相关的效应，提示全天维持稳定药物水平可能对衰老过程调节很重要。标准化效应量（Cohen's d）分析确认了这一模式：第 4 周时，六种时钟中有五种在 30 mg BID 下显示负效应量，而其他方案中 ΔBioAge 的下降被更少的时钟检出（图 3c）。
来自文献 35 的 OrganAge 器官特异性变体提供了额外的细分颗粒度。虽然实际年龄器官时钟未检测到显著的（Q < 0.10）ΔBioAge 变化（扩展数据图 4），但若干基于死亡率的器官时钟检测到了。特别是，动脉时钟在所有治疗组的所有时间点都显示相对安慰剂的预测年龄显著更低（ΔBioAge ∈ −6.95 至 −16.57 岁；扩展数据图 5）。胃、脑、胰腺和免疫时钟也在特定组别中记录到显著下降。
这些探索性发现提示，rentosertib 治疗与蛋白质组整体向更年轻的预测生物学年龄谱偏移相关，其中 30 mg BID 方案在方法学多样的时钟中产生最一致的信号。效应先达峰、随后进入平台期的时间模式，值得进一步研究，以确定它反映的是药效学适应、新的稳态平衡，还是 12 周观察窗的局限。
rentosertib 引起的蛋白质组轨迹（Rentosertib-induced proteomic trajectories）
为鉴定血清水平随治疗变化的蛋白，我们对全部 2,841 个被测蛋白分别拟合线性混合效应模型（LMEM），把性别与 BMI 作为固定效应协变量，并纳入"组别 × 时间"交互项，以捕捉在 12 周试验期内相对安慰剂出现分化的轨迹。
在所有治疗组中，rentosertib 显著改变了 326 个蛋白的表达轨迹（Q < 0.10），而安慰剂组仅 2 个（图 4a 与补充表 6）。大多数变化具有方案特异性：237 个蛋白仅在一个组中响应。30 mg BID 组表现出最广泛的蛋白质组反应，有 142 个独特受影响蛋白，与其强烈的跨时钟衰老信号一致。相比之下，30 mg QD 方案仅产生一个显著的时间依赖性变化（IDO1，上调）。有 89 个蛋白在两个或更多治疗组中显示方向一致的变化，提示存在一组无论方案如何都受 TNIK 抑制影响的核心通路（图 4a）。
图 4：rentosertib 在所有治疗组中诱导 326 个蛋白浓度的时间依赖性变化。
单个蛋白的轨迹展示了这些变化的性质（图 4b）。下调最显著的蛋白包括纤维化和细胞外基质（ECM）重塑的驱动因子，如 COL1A1、MMP10 和 FAP。相反，若干参与细胞代谢和应激抵抗的蛋白则呈相反方向（上调）变化，包括 NAMPT（NAD+ 生物合成的限速酶）、抗氧化酶 SOD2 和解毒酶 ALDH1A1。在降低的蛋白中，我们还观察到 PDGFB（一种参与增殖信号的生长因子）水平下降。90 个受影响最大蛋白的热图确认了跨组的时间模式：30 mg BID 和 60 mg QD 方案产生的变化比 30 mg QD 更明显、更持久（扩展数据图 6）。
rentosertib 效应的稳定性（Stability of rentosertib's effects）
第 4 周至第 12 周之间衰老时钟信号的减弱，促使我们探究 rentosertib 的效应是否真的消退，还是这一模式反映了我们衰老时钟分析的局限。
为此，我们把时间当作分类变量重新计算 LMEM，以捕捉非线性蛋白质组轨迹，并据此把每个蛋白的响应分类为持续（sustained）、延迟（delayed）或瞬时（transient）（补充表 7 与方法）。在 30 mg BID 和 60 mg QD 组中，仅 5–9% 的蛋白质组变化是瞬时的（扩展数据图 7a）。这确认了在有效剂量下，rentosertib 的蛋白质组反应在第 12 周仍在继续发展，而非消退。但是，在四种具有公开特征权重的衰老时钟（OrganAgechrono、OrganAgemortality、PAC、ProtAge）所使用的蛋白中，呈持续轨迹的蛋白被过度代表：30 mg BID 组的优势比（odds ratio）为 4.65，60 mg QD 组为 2.19（补充表 8 与扩展数据图 7b）。因此，与生物学衰老最相关的蛋白质组变化属于较持久的治疗效应。
这一发现引出一个悖论式结论：衰老相关蛋白的持续调节本应维持或加深信号，但所有时钟都显示平台期。为解决这一问题，我们检查了从基线到第 4 周、以及从第 4 周到第 12 周生物学年龄变化的关键贡献者。我们鉴定出 35 个独特蛋白，其归一化蛋白表达（NPX）变化在任一"时间窗–时钟"组合中对总 BioAge 变化的贡献超过 3%。在两个时间窗中，最重要的特征都是 LTBP2——TGF-β 信号轴中纤维化的主调控因子40，它恰好是同时存在于全部六种时钟中的唯一重要特征（补充表 9）。其他重要特征涵盖炎性衰老（inflammaging，AGER41）、神经退行（NEFL42）、生殖衰老（FSHB43,44）和细胞衰老（CXCL945），以及一系列纤维化标志物（SPP1、KRT1940、ELN）和其他 ECM 蛋白（COL6A3、MMP12）。在多数情况下，被突出的过程无法清晰区分，这些基因可能同时归属多个类别。
这种异质性，以及纤维化蛋白对聚合时钟信号的过大影响，给区分该药的疗效与潜在延寿效应带来了挑战。要解决这种纠缠，需要与通过不同机制起效的其他抗纤维化药物（如吡非尼酮或尼达尼布）进行比较，但目前没有可比的蛋白质组数据。不过，我们能够通过下一节所述的几项互补分析来处理这一重要问题。
分离延寿效应（Isolating geroprotective effects）
就其本身而言，蛋白质组时钟无法回答生物学年龄下降反映的是衰老调节本身，还是 rentosertib 抗纤维化活性的继发结果。不过，可以通过检查临床疗效与衰老时钟反应之间的解离程度，间接获得提示。如果时钟变化只是疾病负担减轻的下游结果，那么呼吸功能改善最大的方案也应显示最强的衰老逆转。但出现了相反的模式：在原始试验报告中 FVC 增益最大的 60 mg QD 组，其 ΔBioAge 的一致性反而低于 30 mg BID 组。回归分析进一步支持这种解离：在所有六种时钟中，ΔFVC 对 ΔBioAge 的解释方差都极小（中位 R² = 0.06，范围 0.01–0.18，N = 42）。尽管 FVC 只是整体疾病状态的不完整替代指标，但跨时钟一致偏低的解释力，反对了"单纯的疾病改善"这一解释。
为检验 rentosertib 的蛋白质组效应是否独立于其抗纤维化作用、并与正常衰老轨迹相反，我们把治疗引起的蛋白变化与英国（UK）Biobank 中 55,319 名老年人的年龄相关蛋白变化进行了比较。在两个数据集共有的 2,832 个蛋白中，758 个在 UK Biobank 中显示显著的年龄依赖性表达（Q < 0.05，|系数| > 0.005 NPX/年）。相对于背景比例，rentosertib 调节的蛋白在年龄相关蛋白中富集 1.74 倍（P < 0.001）。随后，对每个治疗组，我们把治疗引起变化的方向与正常衰老的方向做相关。30 mg BID 方案显示显著的负相关（Spearman r = −0.30，P < 0.01），表明该方案优先逆转了年龄相关的蛋白质组轨迹。60 mg QD 方案尽管 FVC 反应更优，却没有这种相关（r = −0.097，P = 0.37）。在安慰剂组，蛋白质组变化与正常衰老方向一致，与"疾病进展会加速年龄相关蛋白质组衰退"相符。这一模式支持如下假设：rentosertib 可能独立于纤维化过程而改变衰老进程。不过，我们承认这类计算性、间接证据的局限，并打算寻求直接的实验验证。
蛋白–蛋白相互作用（PPI）分析进一步揭示了两种方案在通路层面如何分化。30 mg QD 组因显著受影响蛋白不足而被排除在该分析之外（图 4a）。在其余组中，60 mg QD 组影响 184 个蛋白（95 个独特），30 mg BID 组影响 231 个蛋白（142 个独特）。两种方案都调节 ECM 重塑和免疫功能簇（补充文件 1），但它们各自独特的蛋白集在性质上不同。仅被 30 mg BID 影响的蛋白富集于代谢通路，包括磷酸戊糖途径、谷胱甘肽和胆固醇代谢（扩展数据图 8a）；而仅见于 60 mg QD 的蛋白富集于 Wnt 信号和更广泛的免疫活动（扩展数据图 8b）。这种通路层面的分化，为"两种方案在总日剂量相当时却在衰老时钟谱上不同"提供了可能的机制解释。
总之，这些分析提示 rentosertib 对生物学年龄的影响不能完全归因于其抗纤维化活性。但要得到确证，仍需在非 IPF 人群中开展研究，使严重纤维化不致混淆解释，例如其他衰老相关疾病患者，或总体健康的长寿人群。
rentosertib 的衰老形态（senomorphic）效应（Rentosertib's senomorphic effect）
作为 rentosertib 在蛋白质组层面抑制细胞衰老潜力的独立证据，我们使用三套已确立的衰老特征集进行了基因集富集分析（GSEA）：SenMayo（测得 91 个蛋白）、CellAge 上调集（93 个已知促进衰老的蛋白）和 CellAge 下调集（116 个已知抑制衰老的蛋白）。在每个组中，蛋白按治疗反应的强度与方向排序，该排序由 LMEM 的时间系数导出（补充表 10–13 与方法）。
安慰剂组与治疗组表现出相反的衰老轨迹（图 5a,b）。在安慰剂组，SenMayo 蛋白在上调蛋白中显著富集（归一化富集分数 NES = 1.48；Q < 0.01），其前沿（leading edge，对 NES 贡献最大的成员）包括 ECM 重塑蛋白（MMP1、MMP3、MMP9、MMP10、MMP13）、白细胞介素（ILs）（IL1B、IL6、IL10、IL13）、生长因子（FGF7、IGFBP4、EGF、GDF15）和趋化因子（CCL20、CXCL1、CXCL3）。所有治疗组都显示相反模式：SenMayo 分数显著为负、CellAge 下调集分数显著为正（Q < 0.05），仅 60 mg QD 在 SenMayo 上例外（Q = 0.17；补充表 14）。有 7 个蛋白出现在每个治疗组的 SenMayo 前沿中：EREG、ESM1、IGFBP4、ITGA2、MMP10、MMP13 和 SPP1（图 5c）。在 CellAge 下调集中，FOS 和 DPY30 在安慰剂与所有治疗组之间表现出不一致的动态（图 5d）。这些循环蛋白模式与 rentosertib 的衰老形态（senomorphic）效应一致，此前已在体外得到展示46。
图 5：rentosertib 下调参与细胞衰老的蛋白。
随后，我们检验了 rentosertib 是否调节与衰老有关的更广泛信号通路。针对京都基因与基因组百科全书（KEGG）Medicus 集合（658 个基因集，过滤到 Olink 可测蛋白 >25 个者）的 GSEA 识别出 5 条显著富集的通路，全部涉及生长因子信号：RTK–PLCG–ITPR，以及涉及 MAPK、RAS、ERK 和 PI3K–Akt 的通路（图 5e,f）。这些通路在安慰剂组上调，但在所有治疗组下调（Q < 0.25）。生长因子与营养感应通路是公认的衰老驱动因素，也是热量限制和雷帕霉素的作用靶点，因此它们在 rentosertib 作用下的协同抑制，为观察到的生物学年龄下降提供了合理的机制联系。在更严格的阈值下（Q < 0.10），30 mg BID 组的独特之处在于它没有显著上调细胞因子–Janus 激酶–信号转导与转录激活因子（JAK–STAT）轴，而 30 mg QD（Q < 0.05）和 60 mg QD（Q < 0.10）都上调，且 IL2、IL3、IL4 和 IL12 亚基构成前沿。由于 JAK–STAT 介导的细胞因子信号通过 STAT 激活促进纤维化47，30 mg BID 组缺乏该信号，可能部分解释了其更一致的衰老时钟反应。
针对更大的 Reactome 集合（1,787 个基因集，其中 145 个在本数据中具有 >25 个蛋白）的 GSEA，在所有组中共识别出 64 条显著富集通路（Q < 0.25），其中 36 条在 Q < 0.10 下仍显著（图 6 与补充表 14）。所有通路均表现出一致的调控方向：没有任何通路在两个治疗组之间呈相反的富集符号，也没有任何通路在任何治疗组与安慰剂之间共享符号。30 mg BID 组再次显示最广泛的反应，有 40 条富集通路。如 rentosertib 抗纤维化活性所预期，ECM 重塑通路在 30 mg BID 和 60 mg QD 组下调。两组中还有一些与 ECM 无直接关联的通路受到影响：MET 信号（Q < 0.10，NES ∈ −1.64 至 −1.63）、Gαs 信号（Q < 0.10，NES ∈ −1.65 至 −1.56）、死亡受体信号（Q < 0.25，NES ∈ −1.64 至 −1.39），以及由 IGF 结合蛋白（IGFBP）调控的胰岛素样生长因子（IGF）转运与摄取（Q < 0.10，NES ∈ −1.70 至 −1.66）。具体到 30 mg BID 组，TP53 介导的转录调控（Q = 0.17，NES = 1.40）与脂肪酸代谢（Q = 0.09，NES = 1.45）上调（图 6）。
图 6：rentosertib 治疗改变 ECM 重塑和信号活动。
考虑到 IGFBP4 出现在 SenMayo 前沿、以及 IGF 信号在衰老中的既定作用，IGFBP 通路尤其值得关注。30 mg BID 与 60 mg QD 组共享的前沿包含 15 个蛋白，其中包括与衰老和纤维化相关的蛋白 CCN1、FN1、IGFBP3、IGFBP4 和 SPP1（扩展数据图 9a 与补充表 15）。其中，SPP1 和 FN1 在两组中都显示显著下降趋势（Q < 0.10），而 CCN1 仅在 60 mg QD 组达到显著（Q < 0.05）。为捕捉时间交互系数可能遗漏的非线性变化，我们直接评估了所有可获得的 IGFBP、IGF1R 和 IGF2R（共 10 个蛋白）从基线到各时间点的变化（扩展数据图 9b 与 10）。有 6 个蛋白在所有治疗组中相对基线显著下调：IGFBP-1、IGFBP-4、IGFBP-6、IGFBP-7、IGFBPL1 和 CCN1，其中 CCN1、IGFBP4 和 IGFBPL1 在全部三个方案中都显示最一致的下降。IGF 轴蛋白的这些协同变化，提示了把 TNIK 抑制与生物学衰老的代谢和衰老相关组分联系起来的潜在机制。
讨论（Discussion）
本研究推进了把蛋白质组时钟整合进针对潜在延寿（geroprotector）活性的靶向疾病调节药物的临床研究。rentosertib 2a 期试验被设计为容纳多项基于血清蛋白质组 profiling 的衰老生物学评估：纵向多时钟衰老速率监测、与 UK Biobank 正常衰老轨迹的交叉参照、PPI 分析，以及侧重衰老标志过程的 GSEA。此前的延寿药物试验研究的是长期获批的干预，并把衰老生物标志物作为终点48,49。相比之下，我们提出通过从药物发现与开发的早期阶段就把衰老研究方法应用于新靶点和新药物，来加速延寿药物发现。此处描述的证据提供了一个早期提示：蛋白质组衰老时钟分析能够检测到试验受试者中的衰老特征。
蛋白质组模型是衰老时钟领域最新的进展。它们比表观遗传模型提供更直接、更可解释的机制洞见，因为蛋白是生物学变化的即时执行者。然而，这一新兴技术的采用与精细化程度尚不及表观遗传模型。据我们所知，此前没有研究在临床干预中系统比较过多种蛋白质组衰老时钟。我们选择的六个近期发布的模型最初是用以主要健康人群为主的 UK Biobank 数据训练的，但在 rentosertib 试验这一全部为 IPF 患者的超出适用范围的情形中，它们仍给出相对一致的结果。所有实际年龄时钟都与实际年龄达到强相关（Spearman r > 0.77），线性校正后误差低（RMSE < 4 岁），确认了在疾病状态下仍能稳健检测衰老信号（图 3）。同时，基于死亡率的时钟显示较低的年龄相关性（r ∈ 0.16–0.23），但预测年龄更高（图 2b），与其训练目标一致。虽然按实际年龄训练的时钟比按死亡率训练的时钟更准确（图 3a），但所有模型都检测到治疗相关的年龄下降。来自不同模型的信号汇聚，反对了"时钟特异性伪影"的解释；但这一共同信号反映的是衰老生物学的调节、该药的抗纤维化活性，还是二者兼有，仍有待确定。
我们通过检验"驱动预测生物学年龄变化的蛋白"与"纤维化效应"能否被解离来探讨这一问题。衰老时钟反应最一致的方案 30 mg BID，独特地调节了代谢通路，包括胆固醇代谢、磷酸戊糖途径和谷胱甘肽代谢（图 6b 与补充文件 1）。这些氧化还原稳态与代谢重塑通路代表了既定的衰老机制，并非抗纤维化反应的主要特征。相比之下，60 mg QD 方案在 Wnt 信号和与纤维化过程及靶点结合更直接相关的免疫通路上富集更强。Reactome GSEA 揭示了参与 IGF 转运与摄取的蛋白（如多种 IGFBP）显著下调——这些蛋白已知调节 IGF1 和 IGF2 与其受体的相互作用50,51，支持了我们的假设：rentosertib 影响 IGF 信号，这与"TNIK 抑制可防止小鼠饮食诱导肥胖"的证据一致28。这种协同调控为 TNIK 抑制、衰老衰减与衰老时钟变化之间提供了机制联系，且这一联系区别于 Wnt 介导的纤维化抑制。跨多个时间点的时钟内比较可作为机制解离的额外指示。在我们的案例中，rentosertib 引起的生物学年龄下降在多个时钟中于第 4 周达到峰值，随后进入平台期，尽管单个纤维化相关基因表现出更渐进性的表达变化22。
我们得出结论：尽管衰老时钟是检测生物学年龄整体变化的宝贵工具，其输出最好与额外分析（例如其他多组学衰老队列研究，以及通路层面的 GSEA 分析）结合解读，以排除潜在伪影。要确证 30 mg BID 与 60 mg QD 方案之间的功能差异，需要更直接的实验流程，例如在伦理可行处进行纵向组织取样，随后开展单细胞和/或空间转录组、蛋白质组、表观基因组与组织病理学 profiling；直接量化受累组织与外周组织中的衰老细胞负荷及衰老相关分泌表型（SASP）标志物；正交的多组学时钟；以及带有与功能结局相关联的预设药效学标志物的前瞻性研究。蛋白质组衰老时钟仍带有其他组学时钟常见的局限。建立因果关系仍是挑战，因为它们捕捉的统计趋势可能与代偿性衰老过程及有害衰老过程都相关。因此，较晚时间点生物学年龄的回升或平台期，并不必然意味着有益抗衰老变化的停止，而可能揭示了特定情境下蛋白动态造成的统计伪影。未来的多模态时钟试验可能提供更稳健的结论。然而，即便在本研究纯蛋白质组的设定内，互补分析也让我们得以探究 rentosertib 如何影响人体的衰老与衰老驱动因素。
我们的衰老标志物分析建立在既往体外展示之上：rentosertib 能阻止 IMR-90 细胞中衰老细胞的形成46。GSEA 揭示了安慰剂组与治疗组之间相反的轨迹：安慰剂患者显示强烈的 SenMayo 特征上调，与衰老在 IPF 进展中的已知作用一致52；而所有治疗组都表现出该特征的显著下调。同样，指示衰老逆转的 CellAgedown 基因特征在所有治疗组中上调。在单个蛋白层面，EREG、IGFBP4、MMP10、MMP13 和 SPP1 等衰老标志物在所有治疗组中一致下调。尽管 GSEA 显著性阈值（Q < 0.25）反映的是基因集置换分析的标准方案，但许多在单个时间点和组别中的发现在更严格的统计水平上也可检出（图 5a,b）。
虽然所得结果无法与表观遗传时钟比较，但我们看到若干因素使蛋白质组时钟在本研究情境中成为更优选择。第一，蛋白质组时钟的特征可立即解释，允许对预测进行批判性检查，而 CpG 甲基化标记对生物学过程的影响远不那么直接。第二，来自血样的甲基化谱反映的是造血细胞谱系对刺激的响应，而循环蛋白可能更好地捕捉系统性响应。不过，也可以提出一个反论点，关于两种技术产生的特征范围：现代表观遗传芯片报告近百万个基因组位点的甲基化水平，而蛋白质组芯片仅报告不到 3,000 个蛋白。这种技术限制使某些统计检验不完整或不可能，正如我们的 GSEA 那样：由于芯片与通路特征的交集较小，1,787 条可用 Reactome 通路中仅 145 条能获得富集分数。本工作使用的 Olink 3072 平台不含 TNIK 本身，因此只能对靶点结合进行间接（PPI、GSEA）验证。
除了解释范围之外，蛋白质组时钟还可能允许在传统疗效指标之外优化治疗方案。更高的药物暴露可能激活不同的下游效应因子集合，尤其当靶点饱和、更多游离药物存在时53。因此，亚饱和与超饱和的药物浓度可能根据靶点、转运体和代谢酶的表达模式，在不同组织中诱导截然不同的反应54–60。rentosertib 的半衰期相对较短（7–11 h），单次给药会导致较大的峰谷波动25。如我们此前发表的 rentosertib 临床试验报告所示，60 mg QD 给药达到的最高血浆浓度（Cmax）是两种 30 mg 方案的 2–3 倍22。鉴于我们的衰老时钟分析在较低剂量但更频繁的 30 mg BID 方案中识别出比 60 mg QD 强得多的抗衰老特征，我们假设：更频繁的低剂量给药与更不频繁的高剂量冲击，可能以不同方式与下游激酶级联相互作用，在暴露量相等的情况下引发不同的蛋白质组反应，最终不仅导致循环蛋白质组差异，也导致所观察到的临床反应差异22。
衰老时钟信号在第 4 周出现的平台期，为未来检验提供了额外假设。这一时间模式可能源于：代偿性信号通路抵消持续的 TNIK 抑制（类似癌症耐药机制61）；衰老细胞异质性耗尽了易于获取的年轻化能力；或细胞应激在较晚时间点部分抵消了年轻化收益。这些可能性都提示，最佳的延寿效应可能需要间歇给药方案62–64。我们在若干与时钟和衰老相关的表达轨迹中观察到的、随方案和时间变化的模式，或可为不同阶段 IPF、其他适应症、乃至一般延寿试验的疗法优化提供信息。
在当前美国食品药品监督管理局（FDA）框架下，这类研究最现实的开展方式，不是作为"衰老"适应症的试验，而是作为嵌入已获认可的年龄相关疾病或风险定义疾病临床试验中的探索性药效学分析，或者在安全边际与风险–获益特征合适时，作为非 IPF 老年人群中的早期研究。衰老时钟或衰老终点可作为探索性生物标志物预先设定，但临床声明需要常规临床终点，或经 FDA 生物标志物资格认证项目及 FDA–美国国立卫生研究院（NIH）BEST 框架认证的生物标志物65。一个相关先例是 TAME 试验概念，它提出用二甲双胍针对年龄相关疾病的复合终点进行检验，而非针对衰老本身。另一个显著例子是肥胖/超重药物开发的演变，包括 FDA 批准司美格鲁肽和替尔泊肽用于降低心血管风险66。这两个先例都显示，一个与生物学相关的风险状态可以成为可处理（tractable）的治疗场景。因此，我们提出一个分步框架：第一，在疾病试验中前瞻性地把衰老与衰老生物标志物收集为探索性终点，并探索不同的剂量与给药方案；第二，在非 IPF 的年龄相关或风险富集人群中重复这些效应，这些人群中 IPF 疾病修饰不是主要驱动因素；第三，推进生物标志物资格认证或复合临床终点，以确立延寿证据。
在此视角下，我们的工作体现了这一框架的第一阶段。然而，它的推进与向其他临床项目的扩展伴随着若干后勤与制度性障碍。第一，识别诸如 TNIK 这样的新药靶点，需要以非常有限的数据探查疾病–基因关系。PandaOmics 等多模型 AI 靶点发现工具纳入了在低数据条件下有效的模型，例如在源自科学文献的异构数据图表征上进行随机游走67，从而能够快速、迭代地探索潜在靶点。第二，新药靶点需要大量临床前验证以在人体给药前明确作用机制，而对于 TNIK 这类复杂的调控枢纽蛋白而言，这尤为复杂68。第三，把探索性衰老时钟与蛋白质组分析纳入临床试验方案，需要对这些新兴技术的知情同意与监管监督实践进行审慎考虑。监管者理应期望每一项分析或患者数据的使用都能获得关于疾病或药物机制的知识。因此，所研究的衰老生物学与疾病病理学存在重叠就显得更为重要。
应对这些挑战，使我们得以难得地一窥——尽管有限——rentosertib 效应背后的衰老相关生物学机制，以及因而对其在人类衰老情境中活性的启示。我们既用这一试验设计来检验蛋白质组衰老时钟能否在临床试验中提供稳定、可靠的结果，也用来获得标准临床终点无法获得的关于 TNIK 抑制的机制洞见。尽管结合蛋白质组衰老时钟与衰老标志物分析揭示了潜在的延寿效应，但样本量不大、持续时间较短、以计算方法为主，以及缺乏互补的组学模态，都妨碍了对抗纤维化与抗衰老效应的清晰解耦。不过，我们关于治疗相关衰老形态特征、预测生物学年龄下降和代谢通路调节的发现，值得进一步研究。更一般地说，本文结果支持我们提出的"双用途临床试验设计"策略：在针对特定衰老相关适应症的新药研究中同步评估延寿效应。正如雷帕霉素和二甲双胍——这两种现已获批、目前被积极研究为候选延寿药物的临床药物——所例证的那样，从用于常规疾病适应症到接受严格的延寿活性评估，这一转变可能耗时数十年69,70。相比之下，我们的策略可以实现抗衰老活性的早期检测，并揭示原本会被错过的重定位机会。
方法（Methods）
试验设计与受试者
试验设计
本分析使用了 rentosertib 治疗 IPF 成人的一项 2a 期、多中心、双盲、安慰剂对照、随机、多剂量试验（NCT05938920）的数据。该试验于 2023 年 7 月 19 日至 2024 年 6 月 11 日在中国 22 个中心开展。招募机构的以下伦理委员会与审查委员会批准了本试验：北京协和医院药物临床试验伦理审查委员会；四川大学医学伦理委员会；安徽医科大学第二附属医院药物研究伦理委员会；上海市胸科医院伦理委员会；中国医科大学附属盛京医院伦理委员会；中山大学附属第一医院药物、器械与新技术伦理委员会；天津医科大学总医院伦理委员会；上海市肺科医院伦理委员会；江西省人民医院医学伦理委员会；首都医科大学附属北京友谊医院生命伦理委员会；南方医科大学南方医院医学伦理委员会；郑州大学第一附属医院科研与临床试验伦理委员会；中南大学湘雅医院医学伦理委员会；浙江大学医学院附属第一医院注册用途临床试验伦理委员会；复旦大学附属中山医院医学伦理委员会；海南省人民医院医学伦理委员会；南京大学医学院附属鼓楼医院医学伦理委员会；北京大学首钢医院医学伦理委员会；安徽医科大学附属安徽省胸科医院临床试验伦理委员会；山西医学科学院-山西白求恩医院（山西大医院）临床试验医学伦理委员会；山东大学齐鲁医院药物临床试验医学伦理委员会；以及中南大学湘雅二医院医学伦理委员会。
IPF 成人患者使用交互式响应技术按 1:1:1:1 随机分配，接受口服 rentosertib 30 mg QD、30 mg BID、60 mg QD 或安慰剂（QD）治疗 12 周，并继续使用标准治疗药物。
试验遵循《赫尔辛基宣言》与国际协调理事会药物临床试验质量管理规范（GCP）指南。参与中心的机构审查委员会批准了方案，所有患者提供书面知情同意。试验管理与数据处理由 Fortrea Clinical Pharmacology Services（英国利兹）执行。所有受试者、研究者和分析人员的数据揭盲前均保持盲态。试验设计的完整细节见原始试验报告22。
研究受试者
试验结束后，向完成试验的全部 55 名受试者提供了蛋白质组评估的知情同意书。其中 43 人亲自签署并同意其数据纳入蛋白质组子研究。1 名受试者因第 12 周（试验结束）缺少蛋白质组测量而被排除。该队列的完整汇总统计（包括性别、年龄、BMI 与不良事件）见补充表 1。
数据准备
样本采集与处理
在基线、第 2 周、第 4 周和第 12 周（治疗结束）采集所有受试者的血清样本。样本按标准化流程处理并保存至分析。蛋白表达水平使用 Olink Explore 3072 panel 按厂商标准流程测量。
Olink 数据预处理
Olink Explore 系统产生原始计数数据，通过两步流程转换为 NPX 值：(1) 延伸归一化（extension normalization），(2) 强度归一化（intensity normalization）。在 (1) 中，对每个 assay i 和样本 j，assay 计数除以同一样本的延伸对照值，随后做 log2 变换：
{\mathrm{Extension}}\;{\mathrm{NPX}}_{i,\;j}={\mathrm{log}}_{2}\left(\frac{{\mathrm{counts}}\left({\mathrm{sample}}_{j},\, {\mathrm{assay}}_{i}\right)}{{\mathrm{counts}}\left({{\mathrm{Extension}}\;{\mathrm{Control}}}_{j}\right)}\right)
在 (2) 中，对每块板上的每个 assay，通过减去该板上所有样本（不含对照条）延伸 NPX 值的中位数进行强度归一化：
{\mathrm{NPX}}_{i,\;j}={{\mathrm{Extension}}\;{\mathrm{NPX}}}_{i,\;j}-{\mathrm{median}}\left({{\mathrm{Extension}}\;{\mathrm{NPX}}}_{i}\right)
未使用桥接或锚定对照。剔除按 Olink 质量控制标注为 'EXCLUDED' 的 assay 后，保留 2,841 个蛋白用于后续分析。
衰老时钟与 GSEA 细节
蛋白质组衰老时钟
应用了六种已发表的蛋白质组衰老时钟：ProtAge16；ipfP3GPT37；OrganAgechrono 和 OrganAgemortality35；PAOPAC38 和 PAC36。时钟实现通过统一 Python 库（https://github.com/Insilico-org/proteoclock）标准化。对 OrganAge，我们使用两个常规变体，分别训练用于评估死亡风险或实际年龄，正文中称为 OrganAgemortality 和 OrganAgechrono。对 ProtAge，蛋白表达使用原始归一化流程重新归一化，先用来自 UK Biobank 参考数据的已训练 scikit-learn MinMaxScaler 对象做最小–最大缩放（0–1），再以人群中位数中心化。ProtAge 的接口见 https://github.com/miargentieri/proteomic-age-ukb，模型权重通过直接合作获得。PAOPAC 见 https://github.com/JackieHanLab/PAOPAC。对文献 35 中的器官特异性衰老时钟，蛋白先减去均值、除以标准差做标准化，再乘以文献 35 补充表 3 中给出的标准差。基于死亡率模型的输出按 https://github.com/ludgergoeminne/organAging 的说明转换为年。
时间依赖性治疗效应
使用 statsmodels Python 包为每个蛋白拟合 LMEM，分析各治疗组的时间变化。模型设定为：
\begin{array}{l}\mathrm{NPX}\sim\beta {\rm{o}}+{\beta }_{1}(\mathrm{Group_}30\mathrm{QD})+{\beta }_{2}(\mathrm{Group_}30\mathrm{BID})\\\qquad\qquad\;\;+{\beta }_{3}(\mathrm{Group_}60\mathrm{QD})+{\beta }_{4}(\mathrm{Time})+{\beta }_{5}(\mathrm{Group_}30\mathrm{QD}{\rm\times }\mathrm{Time})\\\qquad\qquad\;\;+{\beta }_{6}(\mathrm{Group_}30\mathrm{BID}{\rm\times }\mathrm{Time})+{\beta }_{7}(\mathrm{Group_}60\mathrm{QD}{\rm\times }\mathrm{Time})\\\qquad\qquad\;\;+{\beta }_{8}(\mathrm{Age})+{\beta }_{9}(\mathrm{Sex})+{\beta }_{10}(\mathrm{BMI})+(\mathrm{Baseline\; NPX})+\varepsilon \end{array}
其中治疗组为指示变量（安慰剂为参照），Time 表示周数（0、2、4 和 12），交互项捕捉相对安慰剂的差异蛋白表达变化。患者特异性随机截距解释个体基线差异。模型拟合使用限制最大似然估计（REML）。我们使用"组别 × 时间"交互系数作为 rentosertib 对蛋白表达效应的主要度量。经 Benjamini–Hochberg 校正后通过 Q < 0.10 阈值的系数被视为显著。
部分结果使用了修改版 LMEM，其中 Time 和"组别 × 时间"项替换为分类项，把每个观测时间点当作单独变量。对这些模型，适用以下蛋白轨迹分类：持续（sustained）——在第 12 周及更早时间点均显著；瞬时（transient）——在第 2 周和/或第 4 周显著但在第 12 周不显著；延迟（delayed）——仅在第 12 周显著。
基因集富集分析
GSEA 使用治疗效应系数（"组别 × 时间"交互）乘以 −log10(P 值) 作为 preranked 基因列表。所有权重还乘以 100 以便可视化。
使用 MSigDB 的 SenMayo 基因集（共 124 个衰老相关蛋白，试验中测得 91 个）评估衰老通路调节71–73。此外，我们使用影响衰老的 CellAge 数据库74,75。所有标注为诱导衰老的基因（N = 370，其中测得 93 个）构成 CELLAGE_UP 基因集。所有标注为抑制衰老的基因（N = 475，其中测得 116 个）构成 CELLAGE_DOWN 基因集。
KEGG MEDICUS76 GSEA 使用从 MSigDB 获取的 c2.cp.kegg_medicus.v2025.1.Hs.symbols.gmt77,78。Reactome79 GSEA 使用从 MSigDB 获取的 c2.cp.reactome.v2025.1.Hs.symbols.gmt。
GSEA 检验与统计量用 Python 的 gseapy 获得80。与 preranked 列表共有 <25 个蛋白的基因集被排除，Q 值对每个基因集使用 1,000 次置换计算。基于 gseapy 输出的自定义可视化在 Plotly 中制作。
统计与可重复性
除另有说明外，多数统计检验的显著性设为 Q < 0.10，GSEA 按标准 GSEA 方案使用 Q < 0.25 作为阈值81。
治疗对生物学年龄的效应使用 Mann–Whitney U 检验在每个时间点进行成对比较（安慰剂 vs 治疗），并采用 Benjamini–Hochberg 多重校正。
IGFBP 相关蛋白的差异蛋白表达用 Python v3.11 scipy.stats 模块的 ttest_rel 做配对 t 检验分析。应用 Benjamini–Hochberg 多重校正程序获得 Q 值。
对衰老标志物轨迹，在 '60 mg QD × Time' 和 '30 mg BID × Time' 两个系数上都相对安慰剂显示显著（P < 0.10）下降的蛋白被鉴定为特征性抗衰老轨迹。
除另有说明外，所有统计检验均为双侧。除我们检验关键结果在无较高级别不良事件的亚队列中稳健性的那些检验外，分析未剔除任何数据。
Cohen's d
使用 Cohen's d 计算标准化效应量，以量化治疗组与安慰剂组之间生物学年龄变化的幅度。对每种衰老时钟在第 4 周和第 12 周，Cohen's d 计算为：
d=\frac{\mu \left({{\mathrm{treatment}}}\right)-\mu\;({{\mathrm{placebo}}})}{{S}_{{\mathrm{p}}}}
其中 μ 表示相对基线的生物学年龄平均变化（ΔBioAge），Sp 为合并标准差，计算为：
{S}_{{\mathrm{p}}}=\sqrt{\,\frac{\left({N}_{{{\mathrm{treatment}}}}-1\right)\times {s}_{{{\mathrm{treatment}}}}^{2}+\left({N}_{{{\mathrm{placebo}}}}-1\right)\times {s}_{{{\mathrm{placebo}}}}^{2}}{{N}_{{{\mathrm{treatment}}}}+{N}_{{{\mathrm{placebo}}}}-2}}
Cohen's d 的 95% 置信区间（CI）用方差近似法估计82：
{\rm{s}}.{\rm{e}}{.}_{d}=\sqrt{\frac{{N}_{\mathrm{treatment}}+{N}_{\mathrm{placebo}}}{{N}_{\mathrm{treatment}}\times {N}_{\mathrm{placebo}}}+\frac{{d}^{2}}{2\times \left({N}_{\mathrm{treatment}}+{N}_{\mathrm{placebo}}\right)}}
\mathrm{CI}=d\pm 1.96\times {\rm{s}}.{\rm{e}}{.}_{d}
Cohen's d 为负值表示相对安慰剂的生物学年龄下降。
UKB 分析
本研究使用 UK Biobank 的 55,319 份蛋白质组样本进行验证。该队列由 54% 女性与 46% 男性受试者组成，中位年龄 71 岁（范围 50–85 岁）。
我们在线性模型中定义正常衰老蛋白轨迹为：
{\rm{NPX}} \sim {\rm{Age}}\left({\rm{years}}\right)+{\rm{Sex}}
758 个与衰老显著相关的蛋白列表，基于年龄系数的显著性（Q < 0.05）及其绝对值过滤（|coef| > 0.005 NPX/年）汇总。幅度阈值排除了年龄效应微不足道的蛋白，在保持统计显著性的同时确保生物学相关性。
为评估 rentosertib 影响的蛋白是否优先与衰老而非疾病改善相关，我们进行了超几何检验，比较蛋白集重叠。背景集由 UK Biobank 与 2a 期试验数据集共有的 2,832 个蛋白组成，代表所有可同时评估年龄关联与治疗效应的蛋白。对每次比较，使用重叠大小（k）、rentosertib 影响集大小（n = 325）、参考集大小（N）和背景大小（M = 2,832）计算 P 值与优势比：
P value = 1 − hypergeometric CDF(k − 1; M, n, N)
\mathrm{Odds}\,\mathrm{ratio}\,\frac{k}{n-k}/\frac{N-k}{M-n-N+k}
对年龄相关蛋白（N = 758，Q < 0.05，|coef| ≥ 0.005）分别在聚合水平和组别特异性水平（60 mg QD：n = 183；30 mg BID：n = 231）进行了独立富集分析。由于 n = 1 数量过少，未对 30 mg QD 进行分析。
为检验 rentosertib 治疗是否逆转年龄相关蛋白轨迹，我们计算了治疗引起的蛋白变化（LMEM 的"组别 × 时间"系数）与年龄相关变化（UK Biobank 的年龄系数）之间的 Spearman 秩相关。对每个试验组，把受治疗显著影响的蛋白（Q < 0.05）与年龄相关蛋白列表（Q < 0.05，|coef| > 0.005）匹配，得到组别特异性数据集（30 mg BID：n = 72；60 mg QD：n = 88）。对安慰剂组，由于 n = 2 数量过少，未应用 Q 值过滤。在此设定下，负相关表示衰老轨迹被逆转，正相关表示与衰老一致。
可解释方差
为量化 dFVC 对生物学年龄变化的贡献，我们对每种衰老时钟使用全部受试者数据（N = 42，具有配对的基线与第 12 周测量）拟合 OLS 回归模型（ΔBioAge ~ dFVC）。计算解释方差（R²）以评估 ΔBioAge 中有多少可归因于呼吸功能改善。
PPI 网络分析
为刻画 rentosertib 影响蛋白的通路特异性，我们使用 StringDB（v12.0）网络界面进行 Markov 网络聚类83。
受 rentosertib 治疗显著影响的蛋白（LMEM 分析中 Q < 0.05）提交至 StringDB 网络服务，以置信阈值 0.4 构建完整相互作用网络。30 mg QD 组因显著蛋白不足（N = 1）被排除在详细通路分析之外。
Markov 网络聚类分析的膨胀参数设为 3，生成组别特异性网络：60 mg QD（93 个独特蛋白形成 18 个簇，其中 8 个含 ≥3 个蛋白）和 30 mg BID（141 个独特蛋白形成 34 个簇，其中 13 个含 ≥3 个蛋白）。簇的描述与成员见补充文件 1。簇根据 StringDB 整合注释，以其主要生物学过程为特征。簇可视化使用 Python 的 networkx 制作。
软件与可重复性
所有分析使用 Python v3.11。ipfP3GPT、OrganAge 和 PAC 时钟的衰老时钟预测可用 proteoclock v1.0.0 库获得（https://github.com/Insilico-org/proteoclock）。LMEM 用 statsmodels v0.14.2 包构建84。Mann–Whitney U 检验与配对 t 检验用 scipy.stats v1.12.0 计算85。多重校正用 Python 的 statsmodels.stats.multitest 模块计算。GSEA 检验与统计量用 Python v3.11 的 gseapy v1.1.9 获得。可视化使用 Python v3.11 的 Plotly v5.23.0 制作，UpSet 图在 Plotly 的 plotly_upset 扩展中制作86。图像保存为 SVG 文件，随后用 Windows 10 上的 Adobe Illustrator v29.6.1 合成面板。Venn 图使用 InteractiVenn 网络工具制作87。
材料可用性
本研究未产生新的独特试剂。rentosertib 由 Insilico Medicine 按良好生产规范（GMP）指南提供，作为原始 2a 期试验的一部分（NCT05938920）。
报告摘要
关于研究设计的更多信息见与本文关联的 Nature Portfolio Reporting Summary。
数据可用性（Data availability）
本研究产生的蛋白质组数据已存入中国国家生物信息中心数据库， accession 号为 OMIX008341。该数据集可按补充表 2 表注中的说明，与其中的匿名预测结果配对使用。
代码可用性（Code availability）
蛋白质组衰老时钟分析代码已在 GitHub 上公开：ipfP3GPT、OrganAgechrono、OrganAgemortality 和 PAC 时钟见 https://github.com/Insilico-org/proteoclock；ProtAge 时钟见 https://github.com/miargentieri/proteomic-age-ukb；OrganAge 时钟原始代码见 https://github.com/ludgergoeminne/organAging；PAC 时钟原始代码见 https://github.com/kuo-lab-uchc/PAC；ipfP3GPT 时钟原始代码见 Open Science Framework：https://osf.io/457w8/；PAOPAC 时钟原始代码见 https://github.com/JackieHanLab/PAOPAC。
致谢（Acknowledgements）
我们感谢 E. Ekimova 在制作图 1 和图 2 中的帮助。感谢 D. Gennert 在准备稿件中的协助。感谢 H. Zhao 提供患者招募过程的细节。我们感谢 C. Satler、Y. Lv 和 C. Wang 在获取和准备受试者 BMI、性别与不良事件数据方面的贡献。感谢 Fortrea Clinical Pharmacology Services（英国利兹）的后勤与组织支持。本研究使用了 UK Biobank 资源（申请号 864207）。
资助（Funding）
作者未获得本工作的专项资助。
伦理声明（Ethics declarations）
利益冲突（Competing interests）
A.Z. 是 Insilico Medicine 的创始人兼首席执行官；该公司为上市公司（3696.HK），开发并使用生成式 AI 进行药物发现与衰老研究。F.G.、S.C.、F.R.、A.A.、M.D.、D.S. 和 H.C. 是 Insilico Medicine 的员工。Insilico Medicine 已开发了一系列针对纤维化疾病的治疗项目，包括用于 IPF 的 rentosertib。其他作者声明无利益冲突。
同行评审（Peer review）
同行评审信息
Nature Biotechnology 感谢 Tamir Chandra、Samuel Crofts 以及其他匿名审稿人对本工作同行评审的贡献。同行审稿报告可在原文处获取。
附加信息（Additional information）
出版者注 Springer Nature 对已发表地图中的管辖权主张以及机构隶属关系保持中立。
扩展数据（Extended data）
扩展数据图 1
Bland-Altman 图显示大多数实际年龄时钟的测量之间存在恒定偏差（红色实线），而基于死亡率的时钟带有比例偏差，会高估较年轻的试验受试者年龄，表现为测量中的斜率。使用 42 名受试者在基线的预测。
扩展数据图 2
比较安慰剂组与治疗组时检测到的衰老速率差异的零分布：全研究队列（A）与剔除试验期间发生较高级别不良事件患者后的队列（B）。该分布通过生成 100,000 个患者标签随机化的样本获得。所报告的发现数量（全队列 21 个、缩减队列 19 个）具有统计学意义，不能归因于随机机会（P < 0.0001）。较高级别不良事件指按不良事件通用术语标准（CTCAE）分级 ≥3 级者。
扩展数据图 3
rentosertib 的平均 ΔBioAge 效应。60 mg QD 剂量在六种衰老时钟中引发出独特反应。经 Benjamini-Hochberg 校正后的单侧 Mann-Whitney U 检验（治疗 vs 安慰剂）显著性以星号表示：^ Q < 0.10，\Q* < 0.05。受试者数：30 mg QD 11 人、30 mg BID 11 人、60 mg QD 9 人，对照安慰剂 11 人。
扩展数据图 4
器官特异性实际年龄 Goeminne 时钟的预测。与"rentosertib 引起的衰老时钟预测"相关。与安慰剂相比，治疗组未识别出显著（单侧 Mann-Whitney U 检验，备择假设：ΔBioAge 更低，Q < 0.10）变化。每次访视 N = 11（30 mg QD）、11（30 mg BID）、9（60 mg QD），对照 n = 11 安慰剂。本图的 Q 值是在隔离于其他时钟 Mann-Whitney U 检验的情况下计算的。柱形表示相对安慰剂的器官特异性生物学年龄相对基线的组平均变化；误差棒为 ±SEM。
扩展数据图 5
器官特异性基于死亡率的 Goeminne 时钟的预测。与"rentosertib 引起的衰老时钟预测"相关。在治疗组与安慰剂之间，动脉、脑、胰腺和胃时钟检测到显著（单侧 Mann-Whitney U 检验，备择假设：ΔBioAge 更低，Q < 0.10）的年龄下降。每次访视 N = 11（30 mg QD）、11（30 mg BID）、9（60 mg QD），对照 n = 11 安慰剂。本图的 Q 值是在隔离于其他时钟 Mann-Whitney U 检验的情况下计算的。^：Q < 0.10；\*：< 0.05。柱形表示相对安慰剂的器官特异性生物学年龄相对基线的组平均变化；误差棒为 ±SEM。
扩展数据图 6
试验全程 90 个特征蛋白水平的热图（N 样本 = 168）。与"rentosertib 引起的蛋白质组轨迹"相关。我们选择在至少 2 个治疗组中对 NPX 有显著（Q < 0.10）效应、且绝对值 > 0.01 的所有蛋白，得到含 90 个蛋白的特征集。该特征集展示 rentosertib 对关键纤维化、免疫和衰老相关蛋白的剂量与时间依赖性效应。
扩展数据图 7
rentosertib 引起的大多数蛋白质组变化并非瞬时。
·(a)：在两个活性剂量组中，大多数受影响蛋白呈延迟反应（仅在第 12 周观察到相对基线的显著变化，Q < 0.10）；18–20% 的受影响蛋白呈丰度的持续变化（在早期时间点检出并维持至试验结束）。
·(b)：在衰老时钟所包含的蛋白子集中，呈持续变化的蛋白比例更大，在两个活性剂量组中达到 29–36%。
扩展数据图 8
rentosertib 诱导的蛋白质组效应结合了抗纤维化与抗衰老活性。
·(a)：由 30 mg BID rentosertib 治疗独特影响的蛋白（共 N = 141）形成的、含 >3 个蛋白的 PPI 簇，呈现多种代谢通路。
·(b)：由 60 mg QD rentosertib 治疗独特影响的蛋白（共 N = 94）形成的、含 >3 个蛋白的 PPI 簇，代表更广泛的 Wnt 相关和免疫活动。
扩展数据图 9
参与 IGFBP 介导的 IPF 调控的蛋白在 rentosertib 作用下下调。
·(a)：来自下调的 Reactome 通路"由 IGFBP 调控的 IGF 转运与摄取"、由 30 mg BID 和 60 mg QD 共享的前沿蛋白。
·(b)：未包含在共享 GSEA 前沿中的其他 IGFBP 相关蛋白的轨迹。阴影区域表示 ±SEM。N = 11（安慰剂）、11（30 mg QD）、11（30 mg BID）和 9（60 mg QD）。
扩展数据图 10
rentosertib 在试验全程调节 IGFBP 的表达。
·(a)：安慰剂组（N = 11）；
·(b)：30 mg QD 组（N = 11）；
·(c)：30 mg BID 组（N = 11）；
·(d)：60 mg QD 组（N = 9）。与"rentosertib 的衰老形态效应"相关。共有 6 个蛋白在所有治疗组中相对基线显著（Q < 0.10）下调：IGFBP-1、−4、−6、−7、IGFBPL1 和 CCN1。其中 CCN1、IGFBP4 和 IGFBPL1 是受影响最一致的蛋白，在所有三个方案中均明显下调。显著性来自每个时间点相对基线的双侧配对 t 检验，并采用 Benjamini–Hochberg 程序进行多重比较校正（^ q < 0.10；\q* < 0.05）。误差棒表示 ±SEM，叠加点为单个患者（显示所有点）。
补充信息（Supplementary information）
·报告摘要（下载 PDF）
·同行评审文件（下载 PDF）
·补充表（下载 XLSX）
·S1：蛋白质组队列汇总描述。
·S2：本研究使用的所有时钟的预测。预测结果可通过哈希包含 NPX 值的列，与中国国家生物信息中心获得的匿名患者条目配对。
·S3：比较所有试验组中基线与各时间点生物学年龄差异的 Wilcoxon 配对检验统计量。
·S4：比较治疗组与安慰剂之间 dBioAge 的 Mann–Whitney U 检验统计量。
·S5：比较相对安慰剂的生物学年龄变化的统计检验汇总。
·S6：连续时间 LMEM 系数，含交互项的 Benjamini–Hochberg FDR 校正。
·S7：分类时间 LMEM 系数，含交互项的 Benjamini–Hochberg FDR 校正。
·S8：衰老时钟特征在持续、延迟或瞬时轨迹蛋白中的富集统计。
·S9：试验各时间点之间年龄预测变化的主要贡献者。
·S10：用于安慰剂组 GSEA 的带权重 preranked 列表。
·S11：用于 30 mg QD 组 GSEA 的带权重 preranked 列表。
·S12：用于 30 mg BID 组 GSEA 的带权重 preranked 列表。
·S13：用于 60 mg QD 组 GSEA 的带权重 preranked 列表。
·S14：聚合 GSEA 分数与前沿基因。
·S15：rentosertib 对参与 IGFBP 介导的 IGF 转运与摄取的 GSEA 前沿蛋白的效应。
·补充数据（下载 ZIP）
·补充文件 1：StringDB PPI 聚类导出：边表、簇描述与节点注释。与"延寿效应的独立性"相关。
权利与许可（Rights and permissions）
开放获取 本文按知识共享署名 4.0 国际许可协议（Creative Commons Attribution 4.0 International License）授权，允许以任何媒介或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要适当署名原作者与来源、提供该许可协议链接，并说明是否作出修改。本文中的图像或其他第三方材料包含在本文的知识共享许可协议中，除非在材料的署名行中另有说明；如果材料未包含在本文的知识共享许可协议中，且您的预期使用不在法定许可范围内或超出许可使用范围，您需要直接从版权持有人处获得许可。要查看该许可协议副本，请访问 http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
References · 参考文献
1. Li, Z. et al. Aging and age-related diseases: from mechanisms to therapeutic strategies. Biogerontology22, 165–187 (2021).
2. Guo, J. et al. Aging and aging-related diseases: from molecular mechanisms to interventions and treatments. Signal Transduct. Target. Ther.7, 391 (2022).
3. Dönertaş, H. M., Fabian, D. K., Fuentealba, M., Partridge, L. & Thornton, J. M. Common genetic associations between age-related diseases. Nat. Aging1, 400–412 (2021).
4. Zhavoronkov, A., Wilczok, D., Ren, F. & Galkin, F. Age-related diseases as a testbed for anti-aging therapeutics: the case of idiopathic pulmonary fibrosis. Aging17, 1911–1928 (2025).
5. Kulkarni, A. S. et al. Geroscience-guided repurposing of FDA-approved drugs to target aging: a proposed process and prioritization. Aging Cell21, e13596 (2022).
6. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M. & Kroemer, G. Hallmarks of aging: an expanding universe. Cell186, 243–278 (2023).
7. Blagosklonny, M. V. Validation of anti-aging drugs by treating age-related diseases. Aging1, 281–288 (2009).
8. Galkin, F., Zhang, B., Dmitriev, S. E. & Gladyshev, V. N. Reversibility of irreversible aging. Ageing Res. Rev.49, 104–114 (2019).
9. Horvath, S. DNA methylation age of human tissues and cell types. Genome Biol14, R115–R115 (2013).
10. Min, M., Egli, C., Dulai, A. S. & Sivamani, R. K. Critical review of aging clocks and factors that may influence the pace of aging. Front. Aging5, 1487260 (2024).
11. Apsley, A. T., Etzel, L., Ye, Q. & Shalev, I. From population science to the clinic? Limits of epigenetic clocks as personal biomarkers. Epigenomics17, 1447–1461 (2025).
12. Crimmins, E. M., Klopack, E. T. & Kim, J. K. Generations of epigenetic clocks and their links to socioeconomic status in the Health and Retirement Study. Epigenomics16, 1031–1042 (2024).
13. Fuentealba, M. et al. Multi-omics analysis reveals biomarkers that contribute to biological age rejuvenation in response to single-blinded randomized placebo-controlled therapeutic plasma exchange. Aging Cell24, e70103 (2025).
14. Teschendorff, A. E. & Horvath, S. Epigenetic ageing clocks: statistical methods and emerging computational challenges. Nat. Rev. Genet.26, 350–368 (2025).
15. Mitteldorf, J. Methylation clocks for evaluation of anti-aging interventions. Aging17, 1082–1090 (2025).
16. Argentieri, M. A. et al. Proteomic aging clock predicts mortality and risk of common age-related diseases in diverse populations. Nat. Med.30, 2450–2460 (2024).
17. Johnson, A. A., Shokhirev, M. N., Wyss-Coray, T. & Lehallier, B. Systematic review and analysis of human proteomics aging studies unveils a novel proteomic aging clock and identifies key processes that change with age. Ageing Res. Rev.60, 101070 (2020).
18. Sun, B. B. et al. Plasma proteomic associations with genetics and health in the UK Biobank. Nature622, 329–338 (2023).
19. Lee-Ødegård, S., Austin Argentieri, M., Norheim, F., Drevon, C. A. & Birkeland, K. I. Reversal of proteomic aging with exercise—results from the UK biobank and a 12-week intervention study. NPJ Aging12, 19 (2025).
20. Yang, Y. et al. Metformin decelerates aging clock in male monkeys. Cell187, 6358–6378 (2024).
21. Pun, F. W. et al. Hallmarks of aging-based dual-purpose disease and age-associated targets predicted using PandaOmics AI-powered discovery engine. Aging14, 2475–2506 (2022).
22. Xu, Z. et al. A generative AI-discovered TNIK inhibitor for idiopathic pulmonary fibrosis: a randomized phase 2a trial. Nat. Med.31, 2602–2610 (2025).
23. Olsen, A. et al. Identification of dual-purpose therapeutic targets implicated in aging and glioblastoma multiforme using PandaOmics—an AI-enabled biological target discovery platform. Aging15, 2863 (2023).
24. Ewald, C. Y. et al. TNIK’s emerging role in cancer, metabolism, and age-related diseases. Trends Pharmacol. Sci.45, 478–489 (2024).
25. Ren, F. et al. A small-molecule TNIK inhibitor targets fibrosis in preclinical and clinical models. Nat. Biotechnol. 43, 63–75 https://doi.org/10.1038/s41587-024-02143-0 (2025).
26. Chen, J. et al. From clock to clock: therapeutic target discovery for aging and age-related diseases. Ageing Res. Rev.112, 102871 (2025).
27. Aladinskiy, V. et al. Discovery of bis-imidazolecarboxamide derivatives as novel, potent, and selective TNIK inhibitors for the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis. J. Med. Chem.67, 19121–19142 (2024).
28. Pham, T. C. P. et al. TNIK is a conserved regulator of glucose and lipid metabolism in obesity. Sci. Adv.9, eadf7119 (2023).
29. Gross, T. J. & Hunninghake, G. W. Idiopathic pulmonary fibrosis. N. Engl. J. Med.345, 517–525 (2001).
30. Chilosi, M. et al. Aberrant Wnt/β-catenin pathway activation in idiopathic pulmonary fibrosis. Am. J. Pathol.162, 1495–1502 (2003).
31. King, T. E., Pardo, A. & Selman, M. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet378, 1949–1961 (2011).
32. Palombella, L., Amrein, M., Bührer, E., Riether, C. & Ochsenbein, A. P1343: TNIK signalling impairs self-renewal and long-term reconstitution capacity of HSCS. HemaSphere7, e78156dc (2023).
33. Kiessling, P. et al. Polyploid cardiomyocytes define disease-specific transcriptional states in the mammalian heart. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.64898/2026.01.31.701472 (2026).
34. InSilico Medicine Hong Kong Limited. Study Evaluating INS018_055 Administered Orally to Subjects With Idiopathic Pulmonary Fibrosis. ClinicalTrials.gov https://clinicaltrials.gov/study/NCT05975983 (2024).
35. Goeminne, L. J. E. et al. Plasma protein-based organ-specific aging and mortality models unveil diseases as accelerated aging of organismal systems. Cell Metab.37, 205–222 (2025).
36. Kuo, C.-L. et al. Proteomic aging clock (PAC) predicts age-related outcomes in middle-aged and older adults. Aging Cell23, e14195 (2024).
37. Galkin, F., Chen, S., Aliper, A., Zhavoronkov, A. & Ren, F. AI-driven toolset for IPF and aging research associates lung fibrosis with accelerated aging. Aging17, 1999–2014 (2025).
38. Xu, H., Chen, J., Chen, D., Mao, K. & Han, J.-D. J. Proteome-aware organ proxy aging clocks. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.64898/2026.04.24.720503 (2026).
39. Schwartz, D. A. et al. Determinants of survival in idiopathic pulmonary fibrosis. Am. J. Respir. Crit. Care Med.149, 450–454 (1994).
40. Oldham, J. M. et al. Proteomic biomarkers of survival in idiopathic pulmonary fibrosis. Am. J. Respir. Crit. Care Med.209, 1111–1120 (2023).
41. Ramasamy, R., Shekhtman, A. & Schmidt, A. M. The multiple faces of RAGE—opportunities for therapeutic intervention in aging and chronic disease. Expert Opin. Ther. Targets20, 431–446 (2016).
42. Yuan, A. & Nixon, R. A. Neurofilament proteins as biomarkers to monitor neurological diseases and the efficacy of therapies. Front. Neurosci.15, 689938 (2021).
43. Gunes, S., Hekim, G. N. T., Arslan, M. A. & Asci, R. Effects of aging on the male reproductive system. J. Assist. Reprod. Genet.33, 441–454 (2016).
44. Zaidi, M. et al. FSH, bone mass, body fat, and biological aging. Endocrinology159, 3503–3514 (2018).
45. Seo, D. H. et al. Chemokine CXCL9, a marker of inflammaging, is associated with changes of muscle strength and mortality in older men. Osteoporos. Int.35, 1789–1796 (2024).
46. Tang, Q. et al. AI-driven robotics laboratory identifies pharmacological TNIK inhibition as a potent senomorphic agent. Aging Dis17, 432–451 (2025).
47. Liu, J., Wang, F. & Luo, F. The role of JAK/STAT pathway in fibrotic diseases: molecular and cellular mechanisms. Biomolecules13, 119 (2023).
48. Rolland, Y. et al. Challenges in developing Geroscience trials. Nat. Commun.14, 5038 (2023).
49. Nielsen, J. L., Bakula, D. & Scheibye-Knudsen, M. Clinical trials targeting aging. Front. Aging3, 820215 (2022).
50. Baxter, R. C. Signaling pathways of the insulin-like growth factor binding proteins. Endocr. Rev.44, 753–778 (2023).
51. Alessio, N. et al. Increase of circulating IGFBP-4 following genotoxic stress and its implication for senescence. eLife9, e54523 (2020).
52. Schafer, M. J. et al. Cellular senescence mediates fibrotic pulmonary disease. Nat. Commun.8, 14532 (2017).
53. de Witte, W. E. A., Danhof, M., van der Graaf, P. H. & de Lange, E. C. M. The implications of target saturation for the use of drug–target residence time. Nat. Rev. Drug Discov.18, 84–84 (2019).
54. Redfern, W. S. et al. Predicting clinical outcomes from off-target receptor interactions using Secondary Intelligence TM. J. Pharmacol. Toxicol. Methods131, 107570 (2025).
55. Kanai, Y. & Endou, H. Functional properties of multispecific amino acid transporters and their implications to transporter-mediated toxicity. J. Toxicol. Sci.28, 1–17 (2003).
56. Gayvert, K. M., Madhukar, N. S. & Elemento, O. A data-driven approach to predicting successes and failures of clinical trials. Cell Chem. Biol.23, 1294–1301 (2016).
57. Evers, R. et al. Disease-associated changes in drug transporters may impact the pharmacokinetics and/or toxicity of drugs: a white paper from the International Transporter Consortium. Clin. Pharmacol. Ther.104, 900–915 (2018).
58. Rodrigues, A. D. & Rowland, A. Profiling of drug-metabolizing enzymes and transporters in human tissue biopsy samples: a review of the literature. J. Pharmacol. Exp. Ther.372, 308–319 (2020).
59. Pang, Z. et al. Mapping cellular targets of covalent cancer drugs in the entire mammalian body. Cell189, 725–738 (2026).
60. Kim, D., Lee, J., Lee, S., Park, J. & Lee, D. Predicting unintended effects of drugs based on off-target tissue effects. Biochem. Biophys. Res. Commun.469, 399–404 (2016).
61. Niederst, M. J. & Engelman, J. A. Bypass mechanisms of resistance to receptor tyrosine kinase inhibition in lung cancer. Sci. Signal.6, re6 (2013).
62. Ilan, Y. Overcoming compensatory mechanisms toward chronic drug administration to ensure long-term, sustainable beneficial effects. Mol. Ther. Methods Clin. Dev.18, 335–344 (2020).
63. Romano, S. et al. Drug holiday of interferon beta 1b in multiple sclerosis: a pilot, randomized, single blind study of non-inferiority. Front. Neurol.10, 695 (2019).
64. Arriola Apelo, S. I., Pumper, C. P., Baar, E. L., Cummings, N. E. & Lamming, D. W. Intermittent administration of rapamycin extends the life span of female C57BL/6J mice. J. Gerontol. Ser. A71, 876–881 (2016).
65. FDA–NIH Biomarker Working Group. BEST (Biomarkers, EndpointS, and Other Tools) Resource (United States Food and Drug Administration, 2016).
66. Do, D. et al. FDA cardiovascular. indication expansion and dispensing of semaglutide/tirzepatide in CVD patients with overweight/obesity. JACC Adv.5, 102575 (2026).
67. Kamya, P. et al. PandaOmics: an AI-driven platform for therapeutic target and biomarker discovery. J. Chem. Inf. Model.64, 3961–3969 (2024).
68. Santos, R. et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nat. Rev. Drug Discov.16, 19–34 (2017).
69. Bailey, C. J. Metformin: historical overview. Diabetologia60, 1566–1576 (2017).
70. Powers, T. The origin story of rapamycin: systemic bias in biomedical research and cold war politics. Mol. Biol. Cell33, pe7 (2022).
71. Mootha, V. K. et al. PGC-1α-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes. Nat. Genet.34, 267–273 (2003).
72. Subramanian, A. et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc. Natl Acad. Sci. USA102, 15545–15550 (2005).
73. Saul, D. et al. A new gene set identifies senescent cells and predicts senescence-associated pathways across tissues. Nat. Commun.13, 4827 (2022).
74. Avelar, R. A. et al. A multidimensional systems biology analysis of cellular senescence in aging and disease. Genome Biol.21, 91 (2020).
75. Chatsirisupachai, K., Palmer, D., Ferreira, S. & de Magalhães, J. P. A human tissue-specific transcriptomic analysis reveals a complex relationship between aging, cancer, and cellular senescence. Aging Cell18, e13041 (2019).
76. Kanehisa, M., Goto, S., Furumichi, M., Tanabe, M. & Hirakawa, M. KEGG for representation and analysis of molecular networks involving diseases and drugs. Nucleic Acids Res.38, D355–D360 (2010).
77. Liberzon, A. et al. The Molecular Signatures Database (MSigDB) hallmark gene set collection. Cell Syst.1, 417–425 (2015).
78. Liberzon, A. et al. Molecular signatures database (MSigDB) 3.0. Bioinformatics27, 1739–1740 (2011).
79. Fabregat, A. et al. Reactome pathway analysis: a high-performance in-memory approach. BMC Bioinf.18, 142 (2017).
80. Fang, Z., Liu, X. & Peltz, G. GSEApy: a comprehensive package for performing gene set enrichment analysis in Python. Bioinformatics39, btac757 (2023).
81. Weidner, C. et al. A protocol for using gene set enrichment analysis to identify the appropriate animal model for translational research. J. Vis. Exp.16, 55768 (2017).
82. Borenstein, M., Hedges, L. V., Higgins, J. P. T. & Rothstein, H. R. Effect sizes based on means. in Introduction to Meta-Analysis (eds Borenstein, M., Hedges, L. V., Higgins, J. P. T. & Rothstein, H. R.) Ch. 4, 21–32 https://doi.org/10.1002/9780470743386.ch4 (Wiley, 2009).
83. von Mering, C. et al. STRING: known and predicted protein–protein associations, integrated and transferred across organisms. Nucleic Acids Res.33, D433–D437 (2005).
84. Seabold, S. & Perktold, J. Statsmodels: econometric and statistical modeling with Python. scipy https://doi.org/10.25080/Majora-92bf1922-011 (2010).
85. Virtanen, P. et al. SciPy 1.0: fundamental algorithms for scientific computing in Python. Nat. Methods17, 261–272 (2020).
86. Lex, A., Gehlenborg, N., Strobelt, H., Vuillemot, R. & Pfister, H. UpSet: visualization of intersecting sets. IEEE Trans. Vis. Comput. Graph. InfoVis20, 1983–1992 (2014).
87. Heberle, H., Meirelles, G. V., da Silva, F. R., Telles, G. P. & Minghim, R. InteractiVenn: a web-based tool for the analysis of sets through Venn diagrams. BMC Bioinf.16, 169 (2015).
程思博 上海体育大学 NSCA-CPT 心理学爱好者
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