Ephedrine Sulfate

中药质量是保障其临床疗效与用药安全的核心要素，中药质量研究始终是中医药行业关注的焦点问题。为完善以《中国药典》为核心的国家药品标准体系，提升中药及中药产品质量标准的科学性与实用性，刘昌孝院士[1]于2016年首次提出中药质量标志物（quality marker，Q-Marker）概念。目前，Q-Marker已发展为中药质量控制领域具有核心指导意义的理论体系[2-4]。近年来，Q-Marker理论体系不断完善，研究路径日益清晰、应用范围持续拓展。然而，Q-Marker研究的核心难点仍在于如何科学辨识与中药功效密切相关的关键活性成分[5]。 中药具有多成分、多靶点的整体调节特点，单一成分难以代表整体药效[6]。G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR）又称7次跨膜结构域受体（7-transmembrane receptors，7TMR），是人类基因组目前已知最大的膜蛋白家族，全球约三分之一的上市药物以GPCR为作用靶点[7]。GPCR作为细胞膜表面受体，其激活过程可通过第二信使［如环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、Ca2+、肌醇1,4,5-三磷酸（inositol 1,4,5-trisphosphate，IP3）］变化、β-arrestin募集等快速信号事件进行实时检测[8]，并进一步延伸至下游转录响应。相比之下，核受体虽然具有明确的转录调控功能，但其配体作用通常需要较长时间的基因表达响应，且受细胞类型和共调节因子影响较大[9]；酶联受体通常针对单一催化步骤，而GPCR信号级联可一次性报告从膜受体到胞内多条下游通路的整合响应[8]；离子通道虽然具有快速响应优势，但其结构多样性、功能状态依赖性及检测体系标准化仍面临一定挑战[10]。GPCR作为细胞膜表面最大的受体家族，是介导内源性信号分子和部分外源性化学物质跨膜信号转导的核心门户，广泛参与神经传导、免疫调节、代谢稳态及心血管功能等生理病理过程[11]。值得关注的是，中药多成分、多靶点的作用特征与GPCR介导的复杂信号网络调控机制具有高度契合性。 已有研究表明，GPCR是多种中药活性成分发挥药效的关键分子靶标群，如小檗碱被鉴定为β2肾上腺素受体（β2-adrenergic receptor，β2AR）的新型天然拮抗剂[12]，罂粟所含的吗啡是强效阿片受体激动剂，表明GPCR是中药活性成分发挥药效的重要分子靶标群[13]。在此基础上，全基因组泛GPCR药物发现平台的构建、人工智能辅助筛选技术的发展、“药靶同筛”策略的提出[14]，以及传统方剂来源抗肺纤维化单体新药研发新策略等[15]，为从中药复杂体系中系统发现GPCR配体提供了新的技术路径[16]，使大规模、高效率的活性成分挖掘成为可能。因此，GPCR兼具疾病相关性、功能可检测性，其受体激活特征能够直接反映中药成分对关键生理调控网络的影响，适合作为连接中药质量评价与现代药理机制研究的核心切入点。 基于上述背景，本文提出以GPCR等靶标为核心构建中药Q-Marker发现策略，有别于传统Q-Marker研究中“以化学成分推导药效”或“依赖网络预测”的固有模式，将“受体-配体精准对接”作为发现Q-Marker的重要验证环节。首先，依据中药传统功效与现代药理研究，遴选与特定病症相关的关键GPCR靶点群，系统建立传统功效与GPCR靶点的映射关系，为Q-Marker的发现提供明确的目标导向。其次，突破传统基于静态图谱和动物表型的评估局限，运用人类全基因组泛GPCR高通量药物筛选平台等功能性筛选平台以及中药多靶标细胞膜色谱智筛分析仪（multi-target cell membrane chromatography intelligent screening workstation，MCMC-ISW2.0）等，对中药提取物、组分或单体成分进行高通量活性评价，筛选出具有明确GPCR激动、拮抗或变构调节活性的候选成分。最终，通过配体结合实验如表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）等验证候选成分与GPCR靶点的直接结合关系，并结合功能实验阐明其下游信号通路调控机制[17]。在此基础上，进一步考察活性成分在药材中的含量代表性、体内暴露特征及靶点可达性，从而保障Q-Marker的可传递性与可溯源性，从而确立经GPCR活性验证且具含量代表性的现代Q-Marker。综上，本研究将中药质量控制从被动的物质检定转变为主动的机制确认，以GPCR等分子靶标为核心，为中药Q-Marker的发现提供实验框架。 1 中药质量控制与Q-Marker理论的提出与发展现状 1.1 中药质量控制 中药质量控制的发展经历了从单一指标成分分析到多成分整体评价。中药的定性鉴别主要依赖薄层色谱法，以个别指标成分或者与对照药材为参考，该方法因特征性强、经济简便、操作便捷，至今被《中国药典》及国际药典所保留，但其应用主要局限于定性鉴别。在定量分析方面，紫外分光光度法曾广泛用于总多糖、总皂苷、总黄酮等成分的测定。然而，该方法存在专属性不足等问题。随着色谱技术的发展，高效液相色谱法逐渐成为主流，最初以1～2个指标成分的定量为主。但中药化学成分的高度复杂性使得单一指标难以全面反映其内在质量。因此，研究者逐渐由单成分定量转向多成分含量测定。例如，同时测定银杏叶中11个黄酮醇类成分、人参中15个皂苷类成分、附子中15个成分等，多成分定量已逐渐成为中药质量评价的重要发展方向[18-21]。然而，该方法仍面临对照品获取困难、检测成本高、分析时间长等限制，在产业化应用中推广受限。截至《中国药典》2025年版，仍有部分中药品种缺乏能够反映整体质量的系统性质量标准，甚至缺少明确的定量指标。面对中药“多成分、多靶点、多层次协同”的复杂特征，如何从复杂化学体系中科学选择具有代表性、有效性和质量可传递性的指标成分，并建立能够真实反映中药内在质量与临床功效关联的质量标准，已成为中药质量控制领域亟待解决的关键科学问题。 1.2 中药Q-Marker理论 2016年，刘昌孝院士团队针对中药质量控制长期存在的“指标成分与临床功效脱节”这一行业痛点，提出“中药质量标志物（Q-Marker）”新概念[1]。中药Q-Marker是存在于中药材、饮片、提取物及复方制剂中固有的或加工过程中形成的、与中药功能属性密切相关的化学物质，能够作为反映中药安全性和有效性的标示性物质。Q-Marker深刻揭示中药质量的科学内涵，其核心是“五原则”，即特有性、有效性、传递性（亦称溯源性）、配伍环境以及可测性，共同构成发现和确认Q-Marker的理论基石。在上述理论框架的指导下，行业并最终形成《中药质量标志物研究技术指南》（T/CACM1638—2025）[22]，为Q-Marker的科学发现与标准化应用提供了明确的方法论框架，标志着该理论从学术共识走向行业技术规范。Q-Marker理论整合了植物次生代谢生物学、中药化学、药理学和中医药配伍理论等多学科知识，突破了以往“唯成分论”的碎片化研究模式，首次提出以“有效性”为导向，贯穿药材饮片、提取物、制剂的质量控制与溯源体系。Q-Marker的提出，使中药质量控制从被动检测转向主动设计，为建立涵盖全产业链的质量标准体系奠定了理论基础。 1.3Q-Marker理论指导下的中药质量控制 Q-Marker理论的应用已广泛覆盖中药材饮片、复方制剂等领域。单味药材方面，茯苓[23]、甘草[24]、当归[25]等大宗药材的Q-Marker已进行系统预测与确认，为这些药材的质量标准提升提供了科学依据。对于复方制剂，证实了丹参素、三七皂苷R1等成分可作为复方丹参滴丸的质量标志物[26]，并阐述了延胡索与白芷配伍能协同促进有效成分的脑组织分布[27]，体现了复方配伍环境对Q-Marker确定的重要性。针对具有“活血与止血”“补气与清热”等反向功效的中药（如三七等），研究者提出了基于功效差异性的Q-Marker精准辨识思路，强调应根据不同主治方向选择对应的Q-Marker[28]，以实现更有针对性的质量控制。 在中药质量标准研究中，Q-Marker正逐步替代或补充原有单一成分的质控指标。例如，在复方丹参滴丸的质量标准中，不再仅以丹酚酸B为指标，而是确定丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸A/B/D/T/U 8个成分为Q-Marker，建立特征指纹图谱，并以丹参素作为主要含量测定指标实现了对君药丹参水溶性成分更全面的质量控制。针对中药复杂体系，Q-Marker理论提出了分层级的质量控制策略。以疏风解毒胶囊为例，通过HPLC同时测定虎杖苷、大黄素、连翘酯苷A、戟叶马鞭草苷等7个Q-Marker，并结合22个共有峰的指纹图谱，实现了对复方多药味的整体质量控制[29-30]。因此，中药Q-Marker理论已成为解决中药复杂体系质量控制问题的关键。 2 中药活性成分是天然GPCR配体库 中医药的临床应用历史悠久且疗效显著。已有多项证据表明，从中药等传统药物中发现的活性成分可以通过GPCR发挥作用。生物碱是中药中最具代表性的一类活性成分，多种生物碱已被证实可直接作用于GPCR发挥治疗效应。小檗碱是从黄连等植物中分离的季铵生物碱，传统用于治疗腹泻和炎症。现代研究表明，小檗碱可作用于α2肾上腺素能受体（α2 adrenergic receptor，α2AR）和5-羟色胺受体（5-hydroxytryptamine receptor，5-HTR），发挥降血糖、调节情绪作用[31]。粉防己碱是从防己中提取的双苄基异喹啉生物碱，可作用于钙敏感受体和多种GPCR发挥抗炎和抗纤维化作用[32]。单萜类成分方面，薄荷醇是薄荷油的主要成分，可激活瞬时受体电位通道8型（transient receptor potential melastatin 8，TRPM8）[33]，同时也可作用于γ-氨基丁酸B型（γ-aminobutyric acid type B，GABAB）受体，发挥镇静和镇痛作用。部分倍半萜内酯类化合物如小白菊内酯可调节趋化因子受体表达，影响肿瘤免疫微环境[34]。二萜类成分方面，雷公藤红素是从雷公藤中分离的醌甲基三萜，被鉴定为大麻素受体CB2的选择性激动剂，具有抗炎和抗纤维化活性[35]。丹参酮IIA是从丹参中提取的菲醌类二萜，可作用于血管紧张素II受体和内皮素受体，发挥心血管保护作用[36]。黄酮类成分方面，芹菜素和木犀草素广泛存在于多种中药中，可作用于γ-氨基丁酸A型（γ-aminobutyric acid type A，GABAA）受体和多种GPCR[37]，发挥镇静、抗焦虑作用。槲皮素和山柰酚可作用于雌激素受体和多种GPCR，具有抗氧化、抗炎和心血管保护作用[38]。此外，从川芎中提取的川芎内酯I是C-X-C基序趋化因子受体4（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）抑制剂；苍术中的苍术酮能激活多巴胺2受体（dopamine 2 receptor，D2R）；黄连中的巴马汀为甲酰肽受体2（formyl peptide receptor 2，FPR2）激动剂；姜黄中的姜黄素可激活G蛋白偶联受体55（G protein-coupled receptor 55，GPR55）与GPR97等[39]。厚朴中首次筛选并鉴定出厚朴酚与和厚朴酚为C-C基序趋化因子受体1（C-C motif chemokine receptor 1，CCR1）的选择性拮抗剂[40]。上述研究为“多靶点”治疗提供了基础。 中药活性成分对GPCR的调控不仅体现在受体层面的直接结合，更涉及下游信号通路的偏向性激活。GPCR与配体结合后，主要通过G蛋白三聚体及β-arrestin蛋白介导下游信号转导，而不同中药成分可差异化地调控2条通路，从而产生生物学效应[41]。例如，人参糖脂蛋白复合物gintonin通过激活GPR40［经蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）及氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ）信号］促进胰岛素分泌，并通过激活GPR55触发Ca2+信号调节细胞迁移[42]；姜黄素与GPR55结合后选择性激活G12/13信号通路，同时可通过GPR40/120及钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII）等机制促进胰高血糖素样肽‑1（glucagon‑like peptide‑1，GLP-1）分泌，参与糖稳态调节[43]；白术酮激活多巴胺D2受体（dopamine D2receptor，D2R）后，通过下调cAMP并上调磷酸化cAMP响应性元件结合蛋白（phosphorylation cAMP responsive element-binding protein，p-CREB）/脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）等下游分子，发挥神经保护作用[44]；黄连中的非洲防己碱作为FPR2偏向性激动剂，通过促进胞葬作用减轻肠道炎症[45]。这种对G蛋白通路与β-arrestin通路的选择性调控，为理解中药“多靶点、多通路”的作用特征提供分子层面的解释。 在构效关系层面，随着冷冻电镜、X射线晶体学等技术的发展，多种天然产物配体与代表性GPCR（如大麻素受体、阿片受体、血清素受体、腺苷受体及苦味受体等）的结合模式已被成功解析[46]。构效关系分析揭示这些分子多靶向GPCR正构位点，通过与内源性配体相似或截然不同的构象占据结合口袋，并借助关键氨基酸残基的特异性相互作用激活或抑制受体活性。具体而言，大麻素受体CB1/CB2的正构口袋呈L型构象，中药来源的大麻素类分子以酰基链深插入口袋内部、极性头部延伸至TM1-TM7界面的方式结合，与内源性配体形成竞争性相互作用，从而差异化调控受体活性[47]。马钱子中的生物碱士的宁可同时激活味觉受体2型成员7（taste receptor type 2 member 7，TAS2R7）、TAS2R10和TAS2R46等多个亚型，展现了单一中药成分对同一家族受体的多靶点作用模式[48]。中药来源化合物的结构多样性决定了其与GPCR结合模式的差异性，进而转化为对受体活性的选择性调控。而单一成分靶向多个受体亚型或不同受体家族的特征，构成了中药“多靶点、多通路”协同治疗的结构基础。这一认知不仅为阐释中药整体疗效的分子机制提供了关键依据，也凸显了天然产物作为GPCR靶向药物研发重要资源的价值。 3 GPCR导向的中药Q-Marker发现策略 3.1 从“化学指纹”到“生物活性指纹” 传统Q-Marker发现主要依赖化学指纹图谱。HPLC、GC-MS、UPLC-Q-TOF-MS等技术结合化学计量学，可系统表征中药复杂化学成分，并通过主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）等方法筛选与批次、产地或质量差异密切相关的特征成分，已成为中药质量评价和潜在Q-Marker筛选的重要手段[49-50]。然而，“化学指纹”本质上仍停留在“成分层面”，难以回答成分是否真正具有生物活性以及其活性与临床功效是否相关。具体而言，指纹相似度并不必然代表药效一致性，高含量成分未必是主要药效成分，微量成分也可能具有显著活性，同时传统指纹图谱难以反映多成分之间的协同/拮抗作用。因此，仅依赖化学组成进行Q-Marker筛选存在化学信息与生物效应脱节的问题，推动Q-Marker发现逐渐由“化学指纹”向“生物活性指纹”发展[51]。 生物活性指纹以药效相关的生物效应或作用靶点为切入点，将化学信息与体外活性、体内暴露及作用机制相结合，为Q-Marker筛选提供更直接的药效依据[52]。目前，Q-Marker发现已逐渐形成多维度的技术路径，主要包括谱效关系、血清药物化学与药动学、代谢组学以及网络药理学等方法，通过分别从化学组成-生物活性、体内暴露、代谢响应及作用靶点等维度建立化学成分与药效之间的关联，为Q-Marker的筛选与验证提供多层次证据[6]。化学指纹回答“有什么”，而生物活性指纹回答“有什么用”，多种方法相互印证，共同组成Q-Marker的发现策略，确保Q-Marker的发现直接与药效相关[53]。化学指纹与常用生物活性指纹方法的优缺点，以及其发现潜在Q-Marker的优势见表1。 3.2靶向GPCR的亲和色谱技术 由于GPCR具有疏水跨膜结构域、分离纯化后构象不稳定以及天然表达水平极低等膜蛋白固有特性，长期以来其基于靶蛋白-配体亲和作用的配体筛选与药理学表征面临着巨大挑战。亲和色谱凭借其高特异性分离能力，在GPCR的固相化、构象表征及配体发现中发挥了不可替代的作用。以亲和色谱为基础的“垂钓”技术进一步发展出从复杂样品中捕获配体或靶标的策略，为GPCR药物发现开辟了新路径[54]。 近年来，细胞膜色谱技术的突破为GPCR固相化提供了保持天然构象和功能活性的新途径。细胞膜色谱将活性细胞膜固定于硅胶表面形成固定相，利用色谱系统模拟药物与受体的特异性相互作用，兼具色谱分离和受体亲和的双重功能，已被广泛用于表征正构位点与变构位点的多重结合特性，并可实现在线筛选激动剂与竞争性拮抗剂[17]。该策略的核心是将活性小分子共价固定于固相载体（如磁珠、琼脂糖凝胶）上，与含有GPCR的细胞膜片段或裂解液孵育后，特异性捕获靶受体，再通过温和洗脱结合质谱鉴定。代表性技术包括亲和纯化-质谱联用、光亲和标记（引入双吖丙啶等光反应基团，捕获瞬时或弱相互作用）、DARTS（drug affinity responsive target stability，利用药物结合后增强蛋白酶抗性的原理）以及细胞热转移分析法（cellular thermal shift assay，CETSA）和热蛋白质组学分析（基于配体结合提高靶蛋白热稳定性）[55]。这些方法无需对小分子进行复杂修饰或可直接在完整细胞中操作，尤其适用于天然产物和结构复杂化合物的靶点发现。然而，将亲和色谱技术直接应用于中药复杂体系的Q-Marker筛选仍面临显著的技术瓶颈。首先是复杂基质的干扰，中药提取物含有大量鞣质、多糖及大分子色素，这些成分极易与固相载体或非溶液分子结合，从而产生干扰。其次是构象失活，GPCR作为多重跨膜蛋白，其三维构象极易发生改变，导致结合口袋丢失。此外，传统的亲和色谱仅能确证物理结合，无法区分结合分子是激动剂还是拮抗剂，更无法揭示其能否真实驱动下游特异性的G蛋白级联信号通路，导致单纯依赖该技术难以深入阐明Q-Marker的分子药效机制。未来的发展方向应聚焦于亲和色谱与多维前沿技术（如天然质谱、结构生物学及功能活性评价系统）的深度联用，从而全面服务于中药Q-Marker的分子机制解析体系。 针对以上局限，本团队进一步提出“药靶同筛”策略，为GPCR药物发现开辟了全新的方法论路径[14]。在技术实现层面，“药靶同筛”策略依托多组学整合平台与高通量功能筛选系统的深度融合，构建了涵盖基因组、转录组、蛋白质组和代谢组的多维度化合物数据库，即本草基因编码天然多样性成分库（Gene‑encoded Natural Diverse Components Repository，GNDC）[56]，并开发多靶标细胞膜色谱智筛分析仪（MCMC-ISW2.0），为多靶点药物筛选提供了高通量平台[17]。同时，以PRESTO（parallel receptorome expression and screening via tranional output）系列检测技术[57]、CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）和组学技术为辅助，构建覆盖主要信号通路的功能活性筛选体系。团队进一步将人工智能与“药靶同筛”深度整合，开发了一系列基于深度学习的“化合物-靶点-疾病”预测模型[58]。AI模型优先推荐高概率“成分-靶点”配对，由多靶标细胞膜色谱仪进行高通量验证，实验数据实时反馈迭代优化，形成“计算预测-色谱初筛-功能验证-模型更新”的闭环系统，大幅缩短GPCR靶点发现周期，为中药Q-Marker的分子机制解析提供技术支撑（图1）。 3.3 GPCR功能活性的高通量筛选平台 GPCRs的功能活性检测建立在其复杂的信号转导网络基础之上。经典的GPCR信号通路通过异源三聚体G蛋白介导，根据G蛋白α亚基的不同可分为Gs、Gi/o、Gq/11和G12/13，分别激活腺苷酸环化酶（adenylyl cyclase，AC）、抑制AC、激活磷脂酶C（phospholipase C，PLC）以及调控鸟苷酸交换因子（Rho guanine nucleotide exchange factor，RhoGEF）等下游效应分子。此外，GPCR还可通过G蛋白非依赖途径（如β-arrestin介导的信号转导）调控下游信号通路并发挥生物学功能。这种信号通路的多样性和复杂性为功能活性检测提供了多个可检测节点，同时也对筛选平台的设计提出了挑战。功能活性高通量筛选的核心在于将受体激活后的生物化学事件转化为可定量检测的光学信号。目前主流的功能活性检测技术主要基于第二信使、报告基因、β-arrestin招募等检测[59-60]（图1）。 3.3.1 基于第二信使的功能活性检测平台第二信使是GPCR激活后最早产生的细胞内信号分子，其浓度变化直接反映受体功能状态。基于第二信使的检测平台主要包括cAMP检测和IP/Ca2+检测两大类[61]。cAMP是Gs和Gi/o偶联受体最重要的第二信使。目前主流的cAMP检测技术包括均相时间分辨荧光共振能量转移（homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF）技术。HTRF技术利用铕穴状化合物（Eu3+cryptate）作为供体、XL665或d2作为受体，通过竞争性免疫检测原理定量细胞内cAMP水平，具有极高的灵敏度，完全兼容384孔和1536孔板操作。对于Gq偶联受体，其激活PLC后产生IP3，进而引起细胞内Ca2+浓度快速升高。基于Ca2+的检测平台主要包括荧光钙指示剂法和发光法。Fluo-4、Fura-2等荧光钙指示剂可通过荧光成像读板机实现实时动力学检测，特别适合配体结合速率和脱敏特性的研究[62]。而发光法检测平台如GloSensor、cAMP检测系统，利用萤火虫荧光素酶基因工程改造的生物传感器将第二信使浓度变化转化为发光信号，具有操作简便、无需洗涤的优势[63]。 3.3.2基于报告基因的功能活性检测平台报告基因检测平台通过将受体激活与报告基因（如荧光素酶、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白等）的表达偶联，实现信号放大，从而提高检测灵敏度。常用的报告基因系统包括cAMP响应元件（cAMP response element，CRE）、血清响应元件（serum response element，SRE）、活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）和激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）等顺式作用元件驱动的荧光素酶报告基因[63]。当GPCR激活引起相应信号通路活化时，荧光素酶表达增加，通过加入荧光素底物即可产生发光信号。基于报告基因检测技术的优势在于信号放大效应显著，能够检测弱效激动剂或部分激动剂的活性，且背景信号低。然而，报告基因检测需要较长的孵育时间（通常4～16 h）以使报告基因充分表达，不适合快速动力学研究，且可能受到化合物细胞毒性或转录调控的干扰。近年来，基于纳米荧光素酶（NanoLuc luciferase，NanoLuc）的报告基因系统因其高亮度、低背景和相对分子质量小等优势受到广泛关注。纳米荧光素酶二分互补技术（NanoLuc binary technology，NanoBiT）和纳米荧光素酶生物发光共振能量转移技术（NanoLuc bioluminescence resonance energy transfer，NanoBRET）进一步拓展了报告基因平台的应用范围，可实现蛋白质-蛋白质相互作用的实时检测，为GPCR偏向性信号转导研究提供了有力工具[63]。 3.3.3基于β-arrestin招募的功能活性检测平台β-arrestin不仅是GPCR脱敏和内化的关键调控因子，还能作为支架蛋白介导G蛋白非依赖的信号转导［如细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）激活］。因此，β-arrestin招募检测成为评估GPCR偏向性激动剂功能活性的重要手段。 除PRESTO系列外，PathHunter酶片段互补（enzyme fragment complementation，EFC）技术也是β-arrestin检测领域的重要平台。该技术将β-半乳糖苷酶分为ProLink（PK）和enzyme acceptor（EA）2个无活性的片段，分别与GPCR和β-arrestin融合表达。当受体激活导致β-arrestin招募时，2个酶片段靠近互补形成完整酶活性，通过化学发光底物检测信号。PathHunter平台已建立超过300种GPCR的检测细胞系，覆盖大部分临床相关靶点[65]。 另一种重要的β-arrestin检测技术是生物发光共振能量转移（bioluminescence resonance energy transfer，BRET）和荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）。通过将GPCR标记荧光蛋白［如黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）］或荧光素酶［如海肾荧光素酶（Renillaluciferase，Rluc）、NanoLuc］，β-arrestin标记互补荧光团，受体与β-arrestin相互作用引起能量转移，产生可检测的比率信号。BRET技术具有天然背景低、无需外源激发的优势，特别适合活细胞实时动力学监测[66]。 3.3.4 高通量筛选平台在中药Q-Marker发现中的局限、挑战与发展方向上述各类GPCR功能高通量筛选平台为中药活性物质的挖掘提供了强大的工具，但在实际应用于中药Q-Marker发现时，仍存在亟待突破的技术局限。首要瓶颈在于中药提取物的理化性质对光学检测信号的严重干扰。基于第二信使（如HTRF、Fluo-4）和报告基因的光学检测平台，极易受到中药粗提物中自发荧光化合物或颜色较深成分的荧光淬灭与背景干扰，导致高通量筛选中出现大量假阳性或假阴性数据[67]。此外，部分中药成分的非特异性细胞毒性也常在需要较长孵育时间的报告基因检测中引发信号偏差。现有的大规模泛靶点筛选系统（如PRESTO-Tango等）高度依赖β-arrestin招募来表征受体激活。然而，中药的多种经典药理作用（如炎症干预、糖脂代谢调控等）更多地依赖于受体对经典G蛋白（Gs、Gi/o、Gq/11等）的特异性激活[68]。若筛选平台仅局限于β-arrestin信号，将遗漏大量G蛋白偏向性的关键活性成分，导致机制研究的严重偏差。 为了真正将GPCR筛选与中药Q-Marker发现结合，未来的技术发展应聚焦于构建G蛋白功能筛选平台。通过引入先进的基因编辑工具构建更灵敏、能在极短时间内捕捉G蛋白构象变化的新型生物传感器，有效规避中药长时间孵育带来的毒性与荧光干扰。在此基础上，GPCR高通量筛选平台在中药Q-Marker发现中的实际作用将得到升华，以“G蛋白介导的分子机制响应”作为标准（如激活Gq纠正代谢紊乱或拮抗Gs缓解炎性因子释放）。 3.4 AI与计算药理学驱动的反向Q-Marker发现 3.5 多组学整合策略在中药Q-Marker发现中的应用 单一组学技术虽能在转录、蛋白或代谢某一层面揭示中药的作用特征，但在面对中药“多成分、多靶点、多通路”的整体调节特点时，往往难以全面阐释其科学内涵。多组学整合策略通过联合转录组测序、蛋白质组学、代谢组学及生物信息学技术等，从基因表达、蛋白调控到代谢响应的不同维度，系统解析中药多组分体系的药效物质基础及其代谢转化规律，构建从化学成分到生物效应的多层次证据链，已成为中药Q-Marker科学辨识的重要依据。在靶向GPCR的中药Q-Marker发现中，多组学整合策略具有独特的应用价值。当前已有研究整合代谢组学与网络药理学，成功预测中药成分与GPCR相关靶点的结合作用，验证了中药成分调控氧化损伤、炎症通路的多靶点效应，明确了毒性相关中药Q-Marker的作用机制[74]。团队将多组学分析技术与全基因组泛GPCR筛选平台[47]、AI虚拟筛选等前沿技术相结合[75]，完成了首个聚焦经典名方“藿香正气”的天然多样性成分数据库（Huoxiang Zhengqi Component Galaxy，HXZQCG）。藿香正气口服液中活性成分柚皮素查耳酮能够结合组胺H2受体（histamine H2 receptor，H2R），且浓度相关性地抑制组胺诱导的cAMP积累，表现出H2R拮抗活性[76]。通过多组学整合手段构建“基因、蛋白、代谢物”多层次分析体系，系统解析中药成分与GPCR靶点的互作网络，为GPCR活性导向的中药Q-Marker精准筛选提供从分子机制到整体效应的全链条研究支撑（图1）。 4GPCR导向Q-Marker的确认与质量标准构建 GPCR活性筛选获得的候选成分需依据Q-Marker“五原则”完成从“活性发现”到“Q-Marker确认”的系统验证。首先，收集涵盖中药材、饮片、提取物以及制剂等多质量层级的代表性样品，采用UPLC/GC-MS等分析技术确定候选成分的含量范围、批次间变异及加工传递规律，评价其特有性、可测性和传递性。其次，通过受体结合实验、剂量- 效应关系、受体亚型选择性及下游功能（G蛋白/β-arrestin）分析，确认候选成分与特定GPCR之间的直接作用及功能效应，并借助拮抗剂阻断、基因敲除/敲低或受体突变等手段，建立“成分-GPCR-药效”关联。在此基础上，结合血清药物化学和药动学等，评估候选成分或其活性代谢物在生理给药条件下能否达到有效暴露水平；对于多糖等难以直接入血的成分，则需考察其经肠道菌群转化后产生的活性代谢物及其对相关GPCR的调控作用。据此，可将候选分子划分为2类：一类为兼具明确的GPCR作用机制、体内暴露基础和药效关联，并满足可测性、传递性等基本要求的核心Q-Marker；另一类为仅具GPCR活性，但尚缺乏充分体内暴露或药效关联证据的候选成分，从而实现从发现阶段向Q-Marker确认阶段的有效过渡。 对于经上述证据链确认的Q-Marker，首先建立HPLC、UPLC或其他适宜方法的含量测定及指纹图谱，以实现对其含量范围、批间一致性和生产过程稳定性的控制。对于其药效高度依赖GPCR功能调控的中药，可进一步以关键GPCR为生物学探针，建立基于受体结合或功能活性的生物效价检测方法，以弥补单纯化学成分含量测定“有量未必有效”的不足。 Q-Marker的确认不能仅关注有效性，需同步评价其安全性。GPCR广泛参与心血管、神经、免疫和代谢稳态，部分中药成分对β-肾上腺素受体（β-adrenoceptor，β-AR）、α-AR、5-HTR、血管紧张素II 1型受体（angiotensin II type 1 receptor，AT1R）等GPCR的异常激活或抑制可能同时构成药效和不良反应的分子基础。因此，可将与不良反应密切相关的GPCR作为安全性评价靶点，通过受体结合、功能活性及剂量-效应关系，明确候选Q-Marker对治疗靶点与潜在毒性靶点的作用谱，并结合体内毒理、暴露水平及安全窗进行综合评估。例如，对于含麻黄碱等具有α/β-肾上腺素受体活性的中药成分，其GPCR活性可解释药效，也提示心率、血压等潜在安全风险；其质量限度不应仅依据含量范围确定，还应考虑其受体效价及安全暴露范围。最终应构建“成分含量-GPCR靶点活性-体内暴露-有效性-安全性”的多维度质量评价体系，使GPCR从单纯的药效机制研究靶点，拓展为联结中药物质基础、临床功效与用药安全的质量评价工具，为建立兼具有效性和安全性指示意义的现代Q-Marker质量标准提供科学依据。 5 GPCR介导的中药多维作用机制网络 5.1GPCR-炎症轴 炎症反应是多数急慢性疾病的共性微环境。在此病理级联中，趋化因子受体（如CCR2、CXCR4）和嘌呤能受体（如P2Y2、P2Y6）作为上游信号枢纽是驱动白细胞趋化、巨噬细胞极化和引发炎症因子风暴的关键开关[77-78]。例如，CCR2/5在代谢性炎症中被异常激活，进而促使巨噬细胞释放促炎介质并诱导靶器官发生炎性死亡[79]。药理学研究表明，具有“活血化瘀、清热解毒”功效的中药，其核心活性成分往往是这些炎症相关GPCR的天然拮抗剂，如芍药苷被证实可特异性靶向抑制CXCR2，从而有效减轻由核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）介导的局部炎症反应[80]。黄芩乙醇提取物则能靶向P2X嘌呤能受体家族（P2X3），通过抑制ERK1/2磷酸化及NF-κB通路显著降低促炎细胞因子分泌[81]。更有趣的是，土茯苓中的落新妇苷不仅能抑制P2Y6受体活性，更能同步下调下游的白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）/CXCR2信号轴，阻断中性粒细胞胞外诱捕网的形成[82]。此外，雷公藤红素作为雷公藤发挥免疫抑制作用的核心成分，其抗炎效能高度依赖于对大麻素受体2（cannabinoid receptor 2，CB2R）的特异性激活，进而抑制M1型巨噬细胞极化和NLRP3炎症小体[82-83]。传统的质量控制往往仅停留在对上述单体成分的化学定量，难以全面反映中药的系统抗炎效价。鉴于芍药苷、雷公藤红素等活性成分能够通过高亲和力结合并特异性调控病理微环境中的核心GPCR，从源头阻断炎症级联放大的始动信号，因此，建立基于此类靶点GPCR结合亲和力与功能活化效价的生物检测法，并将其与化学定量整合，或可确立抗炎免疫调节类中药专属Q-Marker。 5.2 GPCR-代谢轴 代谢综合征［如肥胖、2型糖尿病、代谢功能障碍相关性脂肪性肝病（metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease，MASLD）］的病理演进高度依赖于宿主代谢性GPCR的感应失灵[84]。其中，GLP-1R、游离脂肪酸受体（GPR40、GPR120）以及胆汁酸受体（TGR5）等构成了“肠-肝-胰岛”代谢通讯的基石。中药在代谢重塑方面展现出独特的“受体促泌”或“变构调节”优势，如黄连中的特征成分小檗碱已被证实能有效上调肠道GLP-1的分泌并间接增敏GLP-1R信号通路。在萜类及黄酮类化合物中，三七皂苷Ft1被证实可直接激活脂肪组织中的TGR5，促进白色脂肪褐变并诱导GLP-1释放，从而改善胰岛素抵抗[85]。而广泛存在于西红花中的藏红花酸更是被鉴定为GPR40和GPR120的双重激动剂，其既能促进胰岛β细胞分泌胰岛素，又能增强脂肪细胞的葡萄糖摄取[86]。尽管单一的成分测定不能反映其代谢纠偏的综合能力，但以GLP-1R或TGR5等受体作为分子探针，筛选并定量中药提取物中具有GPCR靶点激动的成分群，或可确立调节代谢类中药Q-Marker。 5.3 GPCR-肠道菌群轴 肠道微生态与宿主的跨界通讯极大程度依赖于微生物代谢产物对宿主细胞膜GPCR的激活[87]。游离脂肪酸受体3（free fatty acid receptor 3，FFAR3，旧名GPR41）和FFAR2（GPR43），广泛分布于肠上皮细胞和免疫细胞表面，其激活能显著维持肠道黏膜屏障的完整性，抑制肠源性内毒素入血引发的系统性炎症[88]。中医“从肠论治”“补气健脾”理论的物质基础部分源于中药中富含丰富的大分子多糖[89]。例如，黄芪多糖、百蕊草多糖等大分子虽难以被直接吸收入血，但可在结肠部位经特定菌群发酵为短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），进而作为内源性配体有效激活宿主的GPR41/ GPR43信号，发挥全身性的免疫调节和靶器官保护作用[90-91]。传统的Q-Marker研究多受限于易被血液吸收的“小分子中心论”，导致大量有效的大分子多糖被排除在质控体系之外。然而，基于GPR41/GPR43介导的机制提示，多糖等大分子通过“宿主-微生物共代谢”产生的具有特定GPCR激动活性的终产物正是其发挥药效的关键。因此，具备特定结构的多糖片段（其降解产物能最大化激动GPR41/GPR43受体）应被纳入补气健脾类中药的Q-Marker体系。 5.4 GPCR-神经心血管轴 心血管疾病（如心力衰竭、血管硬化等）的发生和恶化在宏观血流动力学血流动力学层面上高度依赖于“神经-体液压力轴”的失控[92]。在此过程中，GPCR充当了致命的信号放大器。其中，交感神经末梢释放的去甲肾上腺素过度激活心肌和血管上的β-AR，诱发心肌耗氧量剧增和细胞凋亡。同时，过度激活的肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）通过血管紧张素II的1型受体（angiotensin II type 1 receptor，AT1R）强力引发血管痉挛，并启动不可逆的转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/ Smad纤维化重塑程序[93]。在临床干预中，中医药体现出“柔性多靶点”调节的极大潜力。例如，从葛根中提取的葛根素、葛根醇可同时靶向AT1R、内皮素A型受体（endothelin type A receptor，ETAR）、β2-AR等多个GPCR，发挥综合的心血管保护作用[94-95]。反之，作为麻黄核心质控成分的麻黄碱，是最早被认识的天然拟交感生物碱，能直接激活α/β-AR并促进内源性儿茶酚胺释放，在发汗解表的同时也解释了其引发心率及血压波动的潜在毒理机制[96]。治疗心血管疾病中药的安全性和有效性须建立在对特定神经-体液GPCR网络的调控之上。因此，利用前沿技术，直接以这些心血管核心GPCR为“钓饵”，筛选并界定中药提取物中具有强亲和力的结合分子，可实现功能导向型Q-Marker发现、构建安全有效的中药质控体系。 6中药成分-靶点-药效-Q-Marker的典型案例 前述研究表明，GPCR活性筛选能够从复杂中药体系中发现具有受体结合或功能调控活性的天然产物，但GPCR活性并不等同于Q-Marker的确立。候选成分还需要进一步结合其来源及含量代表性、GPCR靶点作用、药效关联、体内暴露、传递性及可测性等证据进行综合评价。因此，中药成分- 靶点-药效-Q-Marker的典型案例不仅关注“中药中有什么活性成分”，还应进一步回答“该成分作用于什么GPCR、产生何种功能效应、是否与中药功效直接相关，以及是否具备作为Q-Marker的质量控制价值”。基于这一思路，选取小檗碱、左旋延胡索乙素以及吴茱萸来源的成分（Evodia rutaecarpa-15，ER-15）等具有代表性的案例进行系统分析（表3）。 小檗碱是黄连、黄柏的主要活性成分，长期以来已作为相关中药的指标性成分用于质量控制。有研究利用自主建立的负向生存压力选择系统（negative survival pressure selection system，nSPS），从天然产物中高通量筛选GPCR拮抗剂，发现去亚甲基小檗碱可作为β2AR的天然拮抗剂[12]。该研究进一步从受体药理学层面建立了小檗碱与β2AR之间的直接作用关系，为其抗应激作用提供了新的分子机制解释。由于小檗碱本身已经具有明确的药材来源、质量控制基础和可测定性，其GPCR靶点及功能活性证据进一步补充了传统化学指标成分的有效性证据。因此，小檗碱属于由传统指标成分向具有明确靶点功能证据的Q-Marker进一步发展的典型案例，提示传统质量指标可以通过GPCR功能验证获得更加明确的药效学内涵。 L-THP是延胡索的重要活性生物碱，具有镇痛、镇静等药理作用，其作用机制与多巴胺D1、D2受体等GPCR密切相关。在元胡止痛滴丸的Q-Marker研究中，通过“性味-响应-成分”三元关系分析并结合实验验证，确定延胡索乙素和原阿片碱等成分与苦味相关药效密切相关，进一步将传统性味理论与现代药效物质基础联系起来[97]。L-THP通过调节多巴胺受体介导的神经信号参与镇痛作用，使其具备较为明确的“中药成分-GPCR-药效”关联。该案例表明，GPCR不仅能够作为现代药理机制研究的分子靶点，还可以与中药传统功效及复方Q-Marker研究相结合，从而为具有明确传统功效属性的候选Q-Marker提供靶点层面的有效性证据。 吴茱萸来源的ER-15（吴茱萸次碱-10-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，rutaecarpine-10-O-β-D-glucopyrano-side）则代表了另一种由GPCR靶向筛选反向发现候选Q-Marker的研究模式。刘红月等[98]建立靶点导向的天然产物GPCR配体筛选平台，从吴茱萸总生物碱提取物中发现ER-15能够靶向腺苷A2A受体（adenosine A2A receptor，A2AR）和A2B受体（A2BR），表现为双重拮抗活性。进一步研究表明，ER-15能够阻断腺苷介导的免疫抑制，增强T细胞活性并促进肿瘤细胞凋亡，在动物模型及患者来源肿瘤类器官中均表现出抗肿瘤作用，与程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）抗体联用还可产生协同效应。该案例形成了较为完整的“天然产物发现-GPCR靶点确认-受体功能验证-细胞与体内药效评价”证据链，为从中药复杂体系中反向发现具有明确靶点和药效关联的候选Q-Marker提供了重要范例。但需要指出的是，ER-15目前主要体现为具有明确GPCR药理活性的候选成分，其是否能够进一步确立为正式Q-Marker还需结合其在吴茱萸及相关制剂中的含量代表性、加工传递性、体内暴露以及检测方法等开展系统评价。 GPCR导向的Q-Marker研究大体存在2种典型路径：一是以已有指标性成分为起点，通过GPCR靶点发现和功能验证进一步强化其有效性证据，如小檗碱和L-THP；二是以疾病相关GPCR为靶点，从中药复杂体系中反向筛选具有明确受体活性的天然产物，再进一步开展药效、暴露和质量属性评价，如吴茱萸来源的ER-15。前者有利于提升现有质量标准的药效学内涵，后者则能够突破传统“高含量成分优先”的筛选模式，发现传统指标体系中可能被忽视的低含量高活性成分。需要强调的是，只有同时具备明确的物质基础、GPCR作用证据、药效关联、体内可达性以及良好的可测性和质量传递性的候选成分才具有进一步确立为核心Q-Marker的基础。 7 结语与展望 本文系统总结了以GPCR等关键靶标为切入点的Q-Marker发现策略及其在中药质量评价中的潜在应用。首先，受体亲和色谱、高通量功能性筛选等技术的发展为从复杂中药体系中发现具有明确靶点作用的活性成分提供了新的技术路径，使Q-Marker的筛选能够由传统的化学成分相关性分析进一步拓展至靶点作用与生物活性相结合的证据评价。例如，小檗碱、L-THP以及吴茱萸来源活性成分ER-15等研究表明，GPCR靶点信息能够将中药活性成分与其具体药理效应进一步关联，为从靶点层面阐释Q-Marker的有效性提供依据。其次，GPCR具有丰富的信号转导模式，其配体可通过不同G蛋白及β-arrestin等途径产生差异化的功能效应，部分中药活性成分还可能通过受体变构调节等方式影响受体功能。因此，GPCR相关研究不仅有助于解析中药成分的作用机制，也为理解中药多成分、多靶点及协同调节特征提供了新的分子视角。与此同时，对于部分体内原型暴露有限甚至难以直接入血的中药成分，肠道微生物代谢及肠道局部靶点作用等研究提示，其药效物质基础并不完全取决于血液中原型成分的暴露水平，而需要结合代谢转化产物、作用部位及靶点效应进行综合评价。由此，GPCR靶向发现策略有望将中药成分、分子靶点、体内暴露与药效效应进一步关联，推动Q-Marker评价由单纯的化学成分含量控制向化学属性与生物效应相结合的综合评价模式拓展，为解决中药质量控制中“化学成分与药效关联不足”的问题提供新的研究思路。 以GPCR为核心的Q-Marker研究策略目前仍处于由理论探索、方法学构建向系统应用逐步发展的阶段，现有研究已在活性成分发现、靶点确认及典型案例验证等方面取得一定进展，但距离形成可用于标准化质量控制的成熟体系仍存在较大距离。一方面，目前中药成分与GPCR靶点之间的作用信息仍较为分散，缺乏系统、规范且具有统一评价标准的高质量数据资源。未来可依托泛GPCR筛选平台、计算预测与实验验证相结合的“药靶同筛”策略逐步构建涵盖中药代表性成分、GPCR亚型、作用模式及功能效应的互作图谱和数据库，为Q-Marker的系统发现与预测提供数据基础。另一方面，现有研究较多集中于成分与GPCR之间的体外结合或功能验证，而从成分暴露、靶点作用、整体药效到临床获益的连续证据链仍有待进一步建立。因此，GPCR活性并不能单独作为Q-Marker确定的充分依据，还需要结合成分的体内暴露、药效相关性、特异性及可测性等Q-Marker评价原则进行综合判断。对于具有潜在安全性风险的GPCR活性成分，还应进一步关注其靶点介导的不良效应。例如，某些成分对肾上腺素能受体等GPCR的过度激活可能同时带来心血管等安全性风险，因此，GPCR介导的有效性与安全性应当共同纳入Q-Marker的评价框架，从而体现Q-Marker兼具“有效性指示物”和“安全性指示物”的完整内涵。 此外，将GPCR功能活性检测真正引入中药质量控制体系，还需要解决检测方法的标准化、重复性、基质干扰及实验室间可比性等关键问题。未来可借鉴生物检定和药理活性评价的相关规范，针对不同GPCR及其下游信号通路建立具有明确参考物、剂量效应关系和质量评价参数的标准化检测方法。在此基础上，应进一步关注中药活性成分对不同GPCR信号通路的差异性调节，包括G蛋白和β-arrestin等通路的偏向性效应，并探索其与传统功效表征之间的关联。但需要指出的是，偏向性信号并非所有中药GPCR活性成分的普遍特征，其与“补气、活血、清热”等传统功效之间的对应关系目前仍缺乏充分的系统性证据，因此更适合作为未来深入研究和拓展Q-Marker功效表征维度的重要方向。 综上，GPCR等靶点为连接中药化学成分、分子靶点、体内暴露和药效效应提供了具有潜力的技术切入点，但其作为Q-Marker发现与质量评价核心策略的科学性和适用性仍需通过更多系统研究加以验证。未来通过受体药理学、化学蛋白质组学、药动学、多组学及人工智能等多学科技术的交叉融合，可进一步完善“成分发现-GPCR作用确认-体内暴露评价-药效及安全性关联-Q-Marker确证”的证据链，逐步建立兼顾化学属性、生物活性、有效性和安全性的中药质量评价体系，从而推动中药质量控制由传统的“化学成分含量评价”向“化学属性与生物效应相结合的整合评价”转变，为中药临床疗效保障及质量标准现代化提供科学依据。返回搜狐，查看更多