Isoflurane

“一个时代的企业，不只靠运气，更靠穿越风暴的勇气。” 在浙江绍兴，有这样一位企业家。他不是网红、没有资本加持、也不是明星CEO。但他却带领团队，在医药行业最动荡的二十年里，靠原料药起家，一步步杀入创新药核心阵地，成为“中国药企从仿制走向原创”的缩影之一。 他，就是昂利康制药创始人——方南平。 在集采刀锋之下，在原研专利压制之中，在千军万马挤破头的仿制药赛道，他选择走一条更难的路：自主研发、出海创新、全球合规、抗肿瘤药卡位。 这不是一条捷径，但可能是中国药企唯一的上坡路。 01 绍兴出发：从车间到创业先锋 方南平，1967年生，中国国籍，本科学历，高级工程师和高级经济师。他的创业之路并非一帆风顺，而是从基层做起。最初，方南平在浙江医药新昌制药厂担任员工、分析室主任及质保部常务副部长，打下了扎实的技术和管理基础。正是这些经历为他日后的创业奠定了坚实的基础。 2001年，在浙江嵊州这个并不起眼的小城，方南平带领团队成立了昂利康制药。那时的昂利康只有一间工厂和几台老旧设备，但方南平知道，只有将一种药物做到极致，才能在激烈的市场竞争中站稳脚跟。 初创时期，昂利康专注于化学原料药与制剂的研发与出口，凭借技术优势和品质管理，逐渐在国内市场站稳了脚跟。然而，最初的日子并不轻松，昂利康没有资本加持，也没有明星代言。方南平和他的团队日复一日地努力，把产品合规化、标准化、全球化，积累起了一定的市场份额。 02 打出一片天：从仿制到一体化 2000年代初，中国制药行业正处于“仿制药黄金期”。面对激烈的市场竞争，方南平迅速抓住了市场机遇。他敏锐地意识到，心血管类制剂需求巨大，而口服头孢类抗生素原料药则具备较高的技术壁垒。于是，昂利康逐步在这两个领域建立起了强大的技术壁垒。 更为关键的是，方南平做出了一个重要决策——不再单打独斗，而是实施原料药+制剂一体化模式。这一战略在当时并不常见，但事实证明，这条路径帮助公司控制了全链条的成本与质量，逐渐在行业中建立起了竞争优势。 几年后，昂利康的产品涵盖了α酮酸、吸入麻醉药原料、植物胆固醇、抗雄激素中间体等多个细分领域。昂利康的名字，也逐渐从行业的幕后走向了台前。 03 2018年：上市，不是终点而是起点 2018年，昂利康正式在深圳证券交易所挂牌上市（股票代码：002940），成为公众公司。这一举措不仅让公司获得了资本市场的资金支持，更为昂利康的未来发展提供了广阔的空间。 上市时，昂利康已经不再是那个默默无闻的小厂，而是年营收超10亿元、产品出口覆盖多个国家、制剂销售稳步增长的中型药企。 在上市后，方南平做出了一个重大的战略转型：“我们不能停留在仿制药，要真正走出自己的创新之路。”他深知，未来的竞争不仅仅是价格战，更多的是创新药物的竞争。为此，昂利康开始了自主创新药物的研发和全球化布局。 04 国采冲击：最难的时刻，也是蜕变的契机 2019年，国家集采如火如荼，席卷了整个中国的仿制药市场。昂利康的核心产品“左益”（苯磺酸左氨氯地平片）也中标了第八批国采，价格大幅下降，业绩受到严重冲击。 但方南平并未因此灰心丧气，反而把这次挑战视作公司的蜕变契机。他决定在两个方向发力： 向内挖潜：坚持推进自主改良药物的研发，并布局缬沙坦左氨氯地平等差异化产品。 向外突破：大力拓展海外市场，推进全球GMP认证，进一步增强公司的全球竞争力。 通过这一系列战略调整，昂利康成功度过了集采的寒冬。2025年三季报显示，昂利康的营收回升至15.4亿元，降幅明显收窄，新品的放量也为公司未来的发展注入了新动力。 05 2024年：划时代一跃——签下ALK-N001 2024年2月，昂利康与亲合力（Affinity Therapeutics）签署了协议，获得了创新抗肿瘤前药ALK-N001在大中华区的全部权益，这一里程碑的合作标志着昂利康正式跨入了创新药的核心阵地。 亲合力（Affinity Therapeutics）简介 亲合力是一家致力于研发创新型抗肿瘤药物的生物制药公司，成立于美国，并在全球范围内开展研发合作。该公司专注于开发基于TMEA-SMDC平台的肿瘤药物，这一平台能够实现肿瘤微环境下的精准靶向激活药物，减少传统化疗药物带来的毒副作用。亲合力的首款药物莱古比星（修饰多柔比星）在临床三期试验中已展现出显著优于传统一线化疗方案的疗效和安全性，是肿瘤治疗领域的一项突破性进展。 通过与亲合力的合作，昂利康获得了ALK-N001的独家权益，这款药物有望成为新一代抗肿瘤治疗的代表，也标志着昂利康在全球创新药物领域的突破。 06 多元布局，守与攻的平衡艺术 方南平的管理哲学是“进一寸有一寸的欢喜”。昂利康并非单纯依赖创新药，而是通过多元化战略，构建了更加稳固的业务格局。 昂利康在多个领域发力： 植物甾醇业务（2023年收购科瑞生物）：净利率高达40%，成为稳定现金流来源； 药用辅料胆固醇：用于脂质体/注射载体，已备案待激活，未来价值量大； 宠物药动保业务：异氟烷2025年销量目标翻倍，布局慢病宠物药品类，进军蓝海市场。 昂利康不再是传统意义上的“仿制药厂”，而是拥有原料、制剂、创新药、辅料、动保、出口六位一体的综合型制药平台。 07 未来展望：不止仰望星空，更在脚踏实地 昂利康的故事，并不光鲜。它没有网红级爆品，也没有海外并购炫技，更没有讲高估值泡沫的故事。 但它有真实的生产线、合规的研发平台、不断打磨的产品、坚韧不拔的团队，以及一个始终不肯放弃“向上生长”的灵魂。 在方南平的眼中，未来五年是中国药企洗牌的关键窗口。“能否在全球市场站稳脚跟，不靠模仿，只靠原创，这是我们的终极战役。” 昂利康准备好了。 尾声：他们不是最亮的星，却最接近火焰 有人说，中国药企缺的是原创精神。但我看，像昂利康这样一步步从绍兴小厂走到抗肿瘤创新药大舞台的公司，才是真正值得敬畏的“中国制药力量”。 他们也许没有惊艳时刻，却始终在黑夜中前行。 愿更多中国药企，如昂利康般，走出仿制的围城，奔向原创的晨光。

喜欢我们，设为星标，接收最新类器官进展与资讯！知识星球搜索“肠道类器官”获取更加专业的培养基配方、标准方案、AI类器官工具和技术手册。  传播科学知识 促进同行交流 推动产业发展 服务国家战略  本公众号由Organoid Agent智能体强力赋能，让您的类器官研究始终站在潮头浪尖！ 推荐语       该研究针对脊髓损伤修复中现有脊髓类器官难以精准复现胸段脊髓区域异质性与空间结构的科学问题，提出工程化胸段脊髓类器官（enTsOrg）解决方案。其以成纤维细胞来源的诱导多能干细胞为基础，结合层状双氢氧化物（LDH）与基底膜水凝胶构建，可精准匹配胸段移植位点。在脊髓损伤小鼠模型中，enTsOrg 展现出高级成熟度与功能化特性，能有序分布关键神经元亚型，重建神经环路并恢复后肢运动功能。机制上，LDH 通过调控相关信号通路促进神经元存活与分化。该研究为神经损伤治疗中特定解剖区域类器官设计提供新范式，对推动脊髓损伤修复临床转化具有重要意义。 技术路线图 科学背景与研究现状 一、脊髓损伤治疗的临床困境与医学需求 脊髓损伤（Spinal Cord Injury，SCI）作为中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）严重创伤，已成为全球公共卫生领域的重大挑战。据世界卫生组织统计，全球每年新增 SCI 患者超 130 万人，患者多为青壮年，损伤后常伴随损伤平面以下永久性运动障碍、感觉丧失及自主神经功能紊乱，不仅严重影响患者生活质量，还需长期医疗照护，给家庭与社会带来沉重负担。 从病理机制来看，SCI 分为原发性损伤与继发性损伤两个阶段。原发性损伤由外力直接作用引发，导致脊髓组织撕裂、神经细胞坏死及神经纤维（轴突）断裂；继发性损伤则在原发性损伤后数小时至数周内持续发生，通过炎症反应、氧化应激、兴奋性毒性作用及胶质瘢痕形成等病理过程，进一步扩大损伤范围。其中，胶质瘢痕由星形胶质细胞过度增殖形成，会物理性阻断神经轴突再生，同时释放抑制性分子（如硫酸软骨素蛋白多糖），成为 SCI 修复的核心障碍。 当前临床治疗手段仍以对症支持为主，如早期手术减压解除脊髓压迫、使用甲基强的松龙抑制炎症反应等，仅能延缓继发性损伤进展，无法实现神经组织再生与功能重建。成年哺乳动物脊髓神经元的再生能力极弱，且损伤微环境恶劣，这一现状使得 SCI 修复长期处于 “治疗手段有限、预后极差” 的困境，亟需开发能突破再生瓶颈的创新性治疗策略。 二、神经修复技术的发展历程与现存瓶颈 （一）传统修复技术的探索与局限 在 SCI 修复研究中，科研人员先后尝试了神经生长因子（Nerve Growth Factor，NGF）干预、轴突再生支架植入等技术。神经生长因子可促进神经细胞存活与轴突萌芽，但由于其在体内易被降解，且无法引导轴突定向生长至靶组织，临床效果微弱；生物支架虽能为轴突再生提供物理支撑，但缺乏神经细胞定植所需的微环境，难以形成功能性神经连接。 随着干细胞技术的发展，神经干细胞（Neural Stem Cells，NSCs）移植成为研究热点。NSCs 具有自我更新能力和多向分化潜能，可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，为损伤脊髓补充细胞来源。近年来，诱导多能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPSC）技术的成熟的成熟，解决了 NSCs 来源有限的问题，iPSC 可由患者自身体细胞重编程获得，避免免疫排斥风险，2024 年国际顶尖期刊《柳叶刀》报道的 iPSC 衍生神经细胞移植治疗 SCI 的 Ⅰ 期临床试验，证实了该技术的安全性。 然而，干细胞移植仍存在显著不足：一是细胞分化效率低，移植后仅约 10%-15% 的 NSCs 可分化为功能性神经元，其余多分化为星形胶质细胞，反而可能加重胶质瘢痕；二是细胞存活困难，损伤区域的炎症微环境导致移植细胞凋亡率超 60%；三是缺乏区域特异性，无法匹配脊髓不同节段（颈段、胸段、腰段）的细胞组成与神经环路特征，难以实现精准修复。 （二）类器官技术的兴起与核心短板 类器官（Organoid）技术的出现为 SCI 修复提供了新方向。类器官是通过干细胞三维培养形成的微型器官模型，具有与体内器官相似的细胞异质性、空间结构及部分生理功能。脊髓类器官（Spinal Cord Organoid，sOrg）可模拟脊髓发育过程，分化出运动神经元、中间神经元、胶质细胞等多种细胞类型，且能形成初步的神经环路，为 SCI 治疗提供了 “活体微型移植物”。 目前，脊髓类器官研究已取得一定进展。2022 年，《自然・方法》期刊报道的研究通过调控 Wnt、Retinoic Acid 等信号通路，成功诱导人 iPSC 形成具有背腹轴结构的脊髓类器官，其中运动神经元比例可达 30%。但现有脊髓类器官技术仍存在三大核心短板： 区域特异性缺失：脊髓不同节段具有高度特异的细胞组成与功能，例如胸段脊髓富含调控下肢运动的 HOXC9 阳性运动神经元和 Vsx2 阳性中间神经元，而现有脊髓类器官多为 “通用型”，胸段特异性细胞比例不足 25%，无法精准匹配胸段 SCI 的修复需求，移植后难以与宿主胸段脊髓形成功能整合。 功能成熟度不足：传统方法构建的脊髓类器官，其神经元电生理活性较弱，突触连接密度低，且缺乏髓鞘形成（髓鞘由少突胶质细胞形成，可加速神经信号传导），无法有效传递神经信号，难以实现运动功能恢复。 移植适配性差：类器官与宿主脊髓的界面整合是修复成功的关键，但现有脊髓类器官缺乏与宿主组织匹配的细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM，由蛋白质、多糖等组成，为细胞提供支撑与信号调控），移植后易被宿主免疫细胞识别清除，且难以与宿主神经轴突形成突触连接。 此外，类器官构建的微环境调控机制尚未明确。虽有研究发现层状双氢氧化物（Layered Double Hydroxide，LDH，一种具有层状结构的无机纳米材料，可缓释生长因子、调控细胞信号通路）能促进神经细胞分化，但如何利用 LDH 精准调控脊髓类器官的区域特征与功能成熟，尚未形成系统方案。 三、科学问题的提出与研究必要性 综合上述研究现状，当前 SCI 修复领域面临一个核心科学问题：如何构建具有胸段区域特异性、高功能成熟度且适配移植微环境的脊髓类器官，以突破胸段 SCI 修复中 “细胞不匹配、功能难整合、存活效率低” 的瓶颈，实现神经环路重建与运动功能恢复？ 这一科学问题的解决具有迫切的必要性与重要价值： 从科学层面看，胸段 SCI 占所有 SCI 病例的 40% 以上，是临床高发类型，但由于缺乏胸段特异性修复工具，相关研究长期滞后于颈段 SCI。开发工程化胸段脊髓类器官（Engineered Thoracic Spinal Cord Organoid，enTsOrg），可填补 “胸段特异性类器官构建” 的技术空白，揭示脊髓节段发育的分子调控机制，为脊髓发育生物学研究提供全新模型。 从临床转化层面看，iPSC 衍生类器官的临床试验已证实其安全性，但区域特异性不足导致的修复效率低下，成为制约临床转化的关键瓶颈。enTsOrg 通过精准调控胸段特异性细胞比例、增强神经元成熟度及优化移植微环境，可大幅提升 SCI 修复效果。若该技术成功转化，将使 SCI 治疗从 “泛化干预” 升级为 “节段精准修复”，为全球数百万 SCI 患者带来功能恢复的可能，具有重大社会意义与临床价值。 综上，针对胸段 SCI 修复的工程化脊髓类器官研究，既是突破现有技术瓶颈的必然选择，也是推动神经修复领域从基础研究走向临床应用的关键桥梁，其开展具有不可替代的科学必要性与现实意义。 实验技术方法 一、核心技术：enTsOrg 的构建与培养 enTsOrg 以成纤维细胞来源的诱导多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cells, iPSC）为种子细胞，通过 “生物材料调控 + 分阶段信号诱导” 实现胸段特异性分化，全程需严格控制培养条件与时间节点，关键步骤如下： 1. 前期准备：iPSC 维护与关键试剂配制 （1）iPSC 培养与 pluripotency 验证 细胞来源：野生型成纤维细胞重编程的 iPSC（本研究使用 N12、N13a 细胞系）。 维护条件：Matrigel（Corning, 354277）包被的培养板，使用 mTeSR1 培养基（StemCell Technologies, 85850），37℃、5% CO₂培养。 ** pluripotency 验证 **：通过免疫荧光染色检测多能性标志物 ——OCT4（胚胎干细胞核心转录因子）、TRA-1-60（多能干细胞表面抗原），确保 iPSC 未分化状态（图 1a 基础实验）。 （2）关键试剂与作用（科普：试剂功能对应实验设计逻辑） 试剂名称 浓度 作用机制与实验意义 Y-27632 10 μM ROCK 激酶抑制剂，抑制 iPSC 单细胞解离后的凋亡，保障细胞成球效率 LDN-193189 1 μM BMP 信号通路抑制剂，阻断 iPSC 向中胚层 / 内胚层分化，定向诱导神经外胚层 CHIR99021 3 μM GSK3β 抑制剂，激活 Wnt 信号通路，促进神经干细胞（NSC）增殖与早期神经分化 视黄酸（Retinoic Acid, RA） 0.1 μM 调控脊髓 “头尾轴（A-P）” 发育，诱导 iPSC 向脊髓尾侧（胸段 / 腰段）分化，而非脑区细胞 Purmorphamine 1 μM SHH 信号通路激动剂，促进神经干细胞向腹侧运动神经元（MN）分化 BDNF/GDNF 10 ng/ml 神经营养因子，分别促进神经元存活 / 突触形成、运动神经元成熟，提升 enTsOrg 功能成熟度 层状双氢氧化物（LDH） 10 μg/ml 无机纳米材料，激活 PTCH1-SHH 通路、调控 RA 信号，提升胸段特异性神经元（HOXC9+/ISL1+）比例 2. LDH 与 LDH-Matrigel 的制备（核心生物材料调控技术） LDH 是实现 enTsOrg 胸段特异性的关键材料，需通过水热合成法制备，并与 Matrigel 复合形成支架，步骤与表征如下： （1）LDH 合成步骤 原料配制：将 NaOH（Sinopharm, 10019718）溶解于无 CO₂双蒸水，加入 Mg (NO₃)₂（80075918）与 Fe (NO₃)₃（80072718），确保 Mg²⁺/Fe³⁺比例符合层状结构形成需求。 预处理：60℃氮气氛围下搅拌 30 分钟，避免氧化影响材料结构；随后离心（转速未明确，常规 10000×g）洗涤 2 次，去除未反应原料。 水热反应：将悬浮液转移至水热釜，100℃恒温 16 小时，使 LDH 晶体充分生长；反应后再次离心洗涤 2 次，4℃保存备用。 （2）LDH-Matrigel 复合支架制备 配比：将 LDH 与 PBS/Matrigel 按 1:9（v/v）混合，终浓度 10 μg/ml，涡旋至均匀无沉淀，确保 LDH 均匀分散于 Matrigel（基底膜水凝胶，提供细胞外基质微环境）。 （3）材料理化表征（科普：表征技术的作用） 表征技术 仪器型号 检测目的与结果 X 射线衍射（XRD） Bruker D2 Phaser 分析 LDH 晶体结构，检测到 003、006、009、110 特征峰，证实 LDH 层状结构完整 X 射线光电子能谱（XPS） Thermo Fisher K-Alpha 分析 LDH 表面元素，检测到 Mg 1s（1296.2 eV）、Fe 2p（700.2 eV），验证元素组成符合设计 圆二色谱（CD） JASCO J-1500 分析 Matrigel 蛋白质二级结构，发现 LDH-Matrigel 仍保持 α- 螺旋构象，保障生物相容性 扫描电镜（SEM） Zeiss GeminiSEM 300 观察形貌：LDH 为直径～100 nm 的六边形片状纳米材料；LDH-Matrigel 表面更粗糙，利于细胞黏附 3. enTsOrg 的分阶段培养流程（时间节点精准控制） 严格按时间节点调控信号通路与培养环境，确保 iPSC 定向分化为胸段脊髓类器官，具体步骤如下： 培养天数 关键操作 培养基 / 试剂调整 Day 0 iPSC 单细胞解离，接种于超低吸附 96 孔圆底板（3×10⁴细胞 / 孔） 含 10 μM Y-27632 的 mTeSR1 培养基，防止细胞凋亡 Day 1 弃去 Y-27632 培养基，更换为神经诱导培养基 基础培养基（DMEM/F12+N2+B27）+1 μM LDN-193189 +3 μM CHIR99021 Day 3 加入 RA，启动脊髓尾侧分化 神经诱导培养基 + 0.1 μM RA Day 10 将神经球（直径～500 μm）包埋于 LDH-Matrigel 液滴中，转移至 24 孔板 分化培养基 + 0.1 μM RA +1 μM Purmorphamine（促进运动神经元分化） Day 14 将包埋的类器官转移至超低吸附 6 孔板，置于摇床（65 rpm）培养，模拟体内动态环境 维持分化培养基成分，促进类器官空间结构形成 Day 17 加入神经营养因子，促进神经元成熟 分化培养基 + 10 ng/ml BDNF +10 ng/ml GDNF Day 21/42 收集类器官用于后续检测（21 天为最佳移植时间，42 天用于成熟度对比） —— （2）对照实验：普通脊髓类器官（sOrg）培养 除 “不添加 LDH、仅用纯 Matrigel 包埋” 外，其余步骤与 enTsOrg 一致，用于对比 LDH 对胸段特异性的调控作用；同时设置 2D 诱导对照（iPSC 接种于 Matrigel 包被盖玻片，Day 10 加 10 μg/ml LDH）。 4. enTsOrg 的多维度检测技术（验证胸段特性与功能） 通过细胞形态 - 分子表达 - 功能活性三级检测体系，验证 enTsOrg 的胸段特异性、神经元成熟度与电生理功能，关键技术如下： （1）细胞层面：免疫荧光染色（检测细胞亚型与分布） 关键步骤： 类器官固定：4% 多聚甲醛（PFA）室温固定 4 小时，15%-30% 蔗糖梯度脱水，OCT 包埋冷冻切片（12 μm）。 封闭与孵育：5% 驴血清 + 0.3% Triton X-100 室温封闭 1 小时；一抗 4℃孵育过夜（抗体信息见表 1）；荧光二抗（Alexa Fluor 系列，1:500）室温孵育 1 小时；DAPI（1 μg/ml）染核 10 分钟。 成像与定量：Zeiss LSM880 共聚焦显微镜成像，ImageJ 软件定量阳性细胞比例。 核心标记物与意义（科普：标记物对应细胞类型）： 标记物 细胞 / 结构类型 实验意义 HOXC9 胸段脊髓特异性神经元 验证 enTsOrg 的胸段区域特性 ISL1/ChAT 运动神经元（MN） 检测运动神经元数量与成熟度 NeuN/NF200 成熟神经元 / 神经纤维 评估神经元成熟度与神经纤维形成 SOX2/Nestin 神经祖细胞（NPC） 监测类器官中祖细胞增殖与分化动态 GAD1/vGlut2 GABA 能 / 谷氨酸能中间神经元 分析抑制性 / 兴奋性神经元比例 （2）分子层面：转录组与蛋白表达检测 1. 空间转录组测序（ST-seq，核心技术）： 科普：与传统 RNA-seq（仅检测基因表达量，丢失空间位置）不同，ST-seq 通过 10× Visium 芯片（6.5 mm×6.5 mm 捕获区，~5000 个 spot，直径 55 μm），保留类器官中基因表达的空间分布信息，可分析 “背腹轴（D-V）”“头尾轴（A-P）” 的基因表达差异。 步骤：类器官切片贴附于芯片，原位裂解 RNA 并与 spot 上的 poly (dT) 引物结合，反转录为 cDNA；构建文库后在 Illumina NextSeq 2000 测序，使用 Space Ranger 软件定量，Loupe Browser 分析空间表达模式。 关键结果：enTsOrg 中 86.61% 的 spot 表现胸段特性（sOrg 仅 65.91%）， ventral 标记基因（如 NKX2.2）与 dorsal 标记基因（如 Pax2）呈空间分区表达。 2. 普通 RNA-seq 与 qPCR： RNA 提取：使用 RNAiso Plus（TAKARA, 9108）提取类器官总 RNA，Nanodrop 检测纯度（A260/A280≈1.8-2.0）。 RNA-seq：北京基因组研究所（BGI）构建文库，DNBSEQ-T7 平台测序（PE150），分析差异基因（如胸段 Hox 基因、神经成熟基因）。 qPCR：使用 PrimeScript 逆转录试剂盒（TAKARA, 2690A）合成 cDNA，TB Green Premix Ex Taq（RR820A）扩增，以 GAPDH 为内参，2^(-ΔΔCt) 法计算基因表达量（验证 Hoxc9、Hoxd9 等胸段基因）。 3. Western blot（蛋白表达验证）： 蛋白提取：RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制剂）提取类器官蛋白，BCA 法测浓度。 检测步骤：SDS-PAGE 电泳（10%-12% 凝胶）→转印至 PVDF 膜→5% 脱脂奶封闭 1 小时→一抗（如 PTCH1、GLI1、p-PI3K）4℃孵育过夜→HRP 二抗室温孵育 1 小时→ECL 化学发光成像，ImageJ 定量条带灰度值。 （3）功能层面：电生理与钙活性检测 1. 多电极阵列（MEA，神经网络活性检测）： 科普：MEA 通过 64 个微电极（直径 30 μm，间距 100 μm）同步记录类器官表面多个神经元的电活动，反映神经网络的整体 firing 模式（如 spike 频率、振幅、网络爆发）。 步骤：35 天类器官接种于 Matrigel 包被的 MEA 板（Axion M384-tMEA-6B），培养 1 周后，Maestro Pro 系统记录 20 分钟，AxIS 软件分析 spike 振幅（enTsOrg 显著高于 sOrg）、firing 频率（enTsOrg 达 1.84 Hz，sOrg 仅 0.56 Hz）。 2. 全细胞膜片钳（单个神经元电生理）： 科普：通过玻璃微电极（4-6 MΩ）与神经元细胞膜形成高阻封接（>1 GΩ），直接记录单个神经元的动作电位（AP）、离子电流（如钠电流 INa、钾电流 IK），是评估神经元功能成熟度的 “金标准”。 步骤：类器官置于人工脑脊液（ACSF，含 NaCl、KCl、CaCl₂等，模拟体内环境），电流钳模式下记录自发 AP（sAP）与诱发 AP（iAP，10 pA 步阶刺激 500 ms）；电压钳模式下记录 INa（-80~+60 mV ramp 刺激）。结果显示：enTsOrg 的 iAP 数量（10.31 次）显著高于 sOrg（5.12 次），INa 峰值（-1004.71 pA）更大。 3. 钙成像（神经元活性动态监测）： 原理：神经元兴奋时 intracellular Ca²⁺浓度升高，Fura-2/AM（钙荧光探针）在 340 nm/380 nm 激发下的荧光比（340/380）可定量 Ca²⁺浓度，反映神经元活性。 步骤：类器官用 5 μM Fura-2/AM 37℃负载 30 分钟，HBSS 洗涤后，Sutter DG4 波长切换器激发，Hamamatsu ORCA-Flash4.0 CCD 采集图像（1 fps），Metafluor 软件分析 ΔF/F₀（ΔF = 瞬时荧光 - 基线 F₀）。结果：enTsOrg 在 KCl 刺激下 Ca²⁺响应更强（AUC=107.0 vs sOrg 95.45）。 二、动物模型与移植验证技术 通过胸段 SCI 小鼠模型验证 enTsOrg 的体内修复效果，关键技术包括模型构建、移植操作与功能评估： 1. SCI 动物模型构建 动物选择：7-8 周龄雌性 NOD-PrkdcscidIl2rgem1/Smoc（M-NSG）小鼠（免疫缺陷，避免类器官排斥），体重 20±2 g。 手术步骤： 麻醉：异氟烷吸入麻醉（1.5%-2% 浓度），背部剃毛消毒。 T9 椎板切除术：暴露 T9 节段脊髓，用显微剪刀行 2 mm 全横断，确认无脊髓连续性。 分组处理： enTsOrg 组：移植 21 天培养的 enTsOrg（LDH-Matrigel 包被）； sOrg 组：移植 21 天培养的 sOrg（纯 Matrigel 包被）； Matrigel 组：仅移植 Matrigel； SCI 组：仅横断不移植； 假手术组：仅椎板切除不横断。 术后护理：每日按摩膀胱 2 次（防止尿潴留），布洛芬镇痛，自由进食饮水。 移植时间选择依据：对比 21 天与 42 天类器官，发现 42 天类器官移植后急性凋亡率更高（TUNEL 阳性细胞多），且 21 天类器官含更多 SOX2 + 祖细胞（利于体内分化），故选择 21 天类器官移植。 2. 体内功能评估技术 （1）行为学检测（运动功能恢复） 1. Basso 小鼠量表（BMS）评分： 每周由 2 名盲法观察者评估小鼠后肢运动（0-9 分，0 分为完全瘫痪，9 分为正常运动），持续 14 周。结果：enTsOrg 组 4 周后 BMS 评分显著高于 sOrg 组，14 周达 6.5 分（sOrg 组仅 3.2 分）。 2. DigiGait 步态分析： 14 周时，小鼠爪部标记墨水，高速相机记录行走步态，DigiGait 软件分析步长（enTsOrg 组达 4.2 cm，sOrg 组 3.1 cm）、支撑时间、步态对称性（enTsOrg 更接近假手术组）。 3. 水平梯子实验： 小鼠在间距不均的梯子上行走，记录后肢踏空率（enTsOrg 组踏空率 18%，sOrg 组 45%），评估运动协调性。 （2）电生理与神经连接验证 1. 运动诱发电位（MEP）： 刺激部位：小鼠运动皮层（暴露脑表面，1.5 mA 电流）；记录部位：坐骨神经（双极电极）；AlphaLab SnR 系统记录信号。结果：enTsOrg 组 MEP 振幅（26.70 μV）显著高于 sOrg 组（9.62 μV），证实神经传导恢复。 2. 光遗传学验证： 原理：通过病毒标记 ChAT + 运动神经元，光抑制后观察电生理与行为变化，验证 enTsOrg 的功能性连接。 步骤：移植前 1 天向 enTsOrg 注射 300 nl rAAV-ChAT-eNpHR3.0-EGFP（AAV2/9，5×10¹² vg/ml），14 周后用 590 nm 黄光照抑制 ChAT + 神经元；记录 MEP 振幅（抑制后下降 35%）与小鼠步态（运动距离减少 20%），证实 enTsOrg 的运动神经元参与宿主神经环路。 3. 神经示踪： 顺行示踪（BDA）：7 周时向运动皮层注射 10% BDA（500 nl / 点，4 个点），2 周后观察 BDA 阳性轴突是否延伸至类器官； 逆行示踪（PRV）：向胫骨前肌注射 PRV-CAG-3Ms 病毒（2×10⁹ pfu/ml），7 天后观察 PRV 阳性细胞是否存在于类器官； 结果：enTsOrg 组可见 BDA/PRV 跨界面信号，sOrg 组仅类器官内有 PRV 信号，证实 enTsOrg 与宿主形成双向神经连接。 三、其他关键辅助技术 缺氧模型验证 LDH 保护作用：6 孔板中 21 天类器官置于厌氧袋构建缺氧环境（2 小时），TUNEL 检测凋亡率，发现 LDH 组凋亡率（12%）显著低于无 LDH 组（28%），证实 LDH 可减轻缺氧诱导的细胞死亡。 安全性检测：通过 HE 染色观察类器官移植后是否增生 / 成瘤，免疫荧光检测癌胚抗原（CEA）是否阳性，结果显示 14 周内类器官体积稳定，无 CEA 表达，证实安全性。 综上，本研究通过 “材料调控 - 类器官构建 - 多维度检测 - 动物验证” 的完整技术链，实现了 enTsOrg 的精准构建与功能验证，其中 LDH-Matrigel 支架调控、ST-seq 空间转录分析、MEA 电生理检测等技术为核心创新点，为胸段 SCI 修复提供了可推广的技术范式。 关键结果图表 该研究针对脊髓损伤（SCI）修复领域的核心问题展开：现有脊髓类器官（spinal cord organoid, sOrg）因难以复现胸段脊髓的区域异质性（如 HOXC9 + 运动神经元等特异性细胞）与精准空间结构，无法匹配胸段移植位点，导致神经环路重建效率低、运动功能恢复有限，这一问题在占 SCI 病例 40% 以上的胸段 SCI 中尤为突出，亟需开发具备区域特异性的类器官工具、、。基于此，研究提出猜想：通过生物材料调控（层状双氢氧化物 Layered Double Hydroxide, LDH 结合基底膜水凝胶 Matrigel）与分阶段信号诱导，从成纤维细胞来源的诱导多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cells, iPSC）构建工程化胸段脊髓类器官（engineered thoracic spinal cord organoid, enTsOrg），可精准复现胸段脊髓的细胞组成与空间结构，移植后能与宿主胸段脊髓形成功能性突触连接，进而重构神经环路并恢复后肢运动功能、。研究思路上，首先通过水热合成法制备 LDH（六边形片状纳米材料，直径约 100 nm），并与 Matrigel 按 1:9（v/v）复合形成 LDH-Matrigel 支架（保留 Matrigel 的 α- 螺旋蛋白结构且表面更粗糙，利于细胞黏附）；随后以 iPSC 为种子细胞，分阶段添加信号分子（LDN-193189、CHIR99021、视黄酸 RA 等）诱导神经分化，Day 10 将神经球包埋于 LDH-Matrigel，后续加 BDNF/GDNF 促进成熟，最终构建 enTsOrg（21 天为最佳移植时间）；同时构建 T9 节段完全横断的 SCI 小鼠模型（免疫缺陷 M-NSG 小鼠），通过行为学、电生理、分子生物学等技术验证 enTsOrg 的体内外效果与机制、、。 一、enTsOrg 在体外具备显著的胸段脊髓区域特性与成熟空间结构 为验证 enTsOrg 的胸段特异性，研究采用空间转录组测序（ST-seq）与免疫荧光技术，结果显示体外培养 21 天时，enTsOrg 中表现胸段脊髓特征的位点占比达86.61%，显著高于普通 sOrg 的 65.91%（图 1f），且胸段特异性基因（HOXC9、HOXB9、HOXD9）的表达水平经 qPCR 与免疫荧光证实均显著高于 sOrg（图 1g、h、i），表明 enTsOrg 能精准复现胸段脊髓的分子特征。从空间结构看，扫描电镜（SEM）观察到 enTsOrg 中心为密集的神经元胞体，周围环绕细长神经纤维，而 sOrg 的神经纤维较短（图 1c）；免疫荧光显示，enTsOrg 中成熟神经元（NeuN+）和神经纤维（NF200+）在 42 天时显著富集，且运动神经元（ISL1+/ChAT+）集中分布于类器官腹侧区域，与体内胸段脊髓的背腹轴（D-V）结构一致，而 sOrg 的神经元分布紊乱（图 1e、i）、。此外，ST-seq 分析发现 enTsOrg 中神经祖细胞（SOX2+、Nestin+）占比 32.24%，成熟神经元占比 67.76%，而 sOrg 中祖细胞占比更高（图 3d、e），说明 enTsOrg 在体外已具备更成熟的细胞组成，为移植后的功能整合奠定基础、。 二、enTsOrg 在体外展现更优的电生理功能与神经元活性 为评估 enTsOrg 的功能成熟度，研究采用多电极阵列（MEA）、全细胞膜片钳与钙成像技术检测。MEA 结果显示，培养 35 天时，enTsOrg 的神经元 spike 振幅显著大于 sOrg（图 1m），单位时间内 spike 数量更多（图 1o），网络爆发模式更复杂（图 1n），表明其神经网络活性更强。全细胞膜片钳记录显示，enTsOrg 中神经元的自发动作电位（sAP）频率达 1.84±0.44 Hz，显著高于 sOrg 的 0.56±0.12 Hz（图 1p）；在 500 ms 电流注射下，enTsOrg 神经元产生的诱发动作电位（iAP）数量为 10.31±1.20 次，远高于 sOrg 的 5.12±1.07 次（图 1q）；同时，enTsOrg 神经元的钠电流（INa）峰值达 - 1004.71 pA，显著大于 sOrg，证实其离子通道功能更成熟、。钙成像实验中，经 60 mM KCl 刺激后，enTsOrg 的胞内钙浓度（[Ca²⁺] i）升高幅度更大，钙响应的面积积分（AUC=107.0±5.60）显著高于 sOrg（AUC=95.45±2.96，图 1s），进一步证明 enTsOrg 的神经元对刺激响应更灵敏，功能活性更优。 三、enTsOrg 移植显著促进胸段 SCI 小鼠的运动功能恢复与神经环路重建 在体内实验中，研究将 21 天的 enTsOrg 移植至 T9 横断 SCI 小鼠模型，14 周行为学监测显示，enTsOrg 组小鼠的 Basso 小鼠量表（BMS）评分从 4 周开始显著高于 sOrg 组，14 周时 enTsOrg 组 BMS 评分达 6.5 分，而 sOrg 组仅 3.2 分（图 2b），且 enTsOrg 组小鼠后肢出现明显背屈和伸展动作，sOrg 组则以拖拽动作为主（图 2c）。DigiGait 步态分析显示，14 周时 enTsOrg 组小鼠的步长（4.2±0.3 cm）、支撑时间（0.45±0.02 s）显著优于 sOrg 组，步态对称性更接近假手术组（图 2d）；水平梯子实验中，enTsOrg 组小鼠后肢踏空率仅 18%，成功放置率达 36%，而 sOrg 组踏空率 45%、成功放置率 13%（图 2f、g），证实 enTsOrg 能显著提升 SCI 小鼠的运动协调性。神经环路重建方面，免疫荧光显示移植 7 周后，enTsOrg 组损伤区域的运动神经元前体细胞（Olig2+）、成熟运动神经元（ISL1+）和神经轴突（MAP2+）密度显著高于 sOrg 组（图 2h）；运动诱发电位（MEP）检测显示，enTsOrg 组的 MEP 振幅达 26.70±8.46 μV，显著高于 sOrg 组的 9.62±2.38 μV（图 2i），表明神经传导功能有效恢复、。此外，生物素化葡聚糖胺（BDA，顺行示踪）与伪狂犬病毒（PRV，逆行示踪）实验显示，enTsOrg 组中 BDA 阳性轴突可从宿主运动皮层延伸至类器官，PRV 阳性细胞可从后肢肌肉追溯至类器官，而 sOrg 组仅类器官内有 PRV 信号，无 BDA 跨界面信号（Extended Data Fig. 4a），证实enTsOrg 能与宿主脊髓形成双向神经连接，实现神经环路重构。 四、LDH 通过调控 SHH 与 RA 信号通路促进 enTsOrg 的胸段特性与神经元成熟 研究探究机制时发现，LDH 是 enTsOrg 功能优势的关键调控因子。体外实验中，Western blot 与免疫荧光显示，enTsOrg 中 SHH 信号通路相关蛋白（PTCH1、GLI1、NKX6.1）的表达显著高于 sOrg（图 6h、i），同时 RA 信号通路中的降解酶 CYP26A1 和受体 RARα 表达也显著升高（图 6i、l），表明 LDH 通过激活 PTCH1-SHH 通路和调控 RA 信号，促进 iPSC 向胸段运动神经元分化、。移植后 7 周，enTsOrg 组中 PI3K/AKT/GSK3β 信号通路的磷酸化水平（p-PI3K、p-AKT、p-GSK3β）显著高于 sOrg 组（图 6m、n），该通路可增强神经元存活与轴突再生；同时，enTsOrg 中泛素介导的蛋白水解通路相关基因（如 UCHL1）和线粒体融合蛋白 MFN2 表达升高，前者促进蛋白降解与神经元成熟，后者维持线粒体功能、减少氧化应激损伤。 该研究总结与结论如下：成功构建的工程化胸段脊髓类器官（enTsOrg），通过 LDH-Matrigel 支架调控和分阶段信号诱导，在体外具备胸段脊髓的区域异质性（86.61% 胸段特性位点）、成熟空间结构与优异电生理功能；移植至胸段 SCI 小鼠模型后，能通过与宿主形成双向神经连接重构神经环路，显著恢复后肢运动功能，其机制与 LDH 调控 SHH/RA 及 PI3K/AKT 通路相关、。该研究的核心价值在于首次实现胸段特异性脊髓类器官的精准构建，突破现有 sOrg 区域匹配性差的瓶颈，为 SCI 修复提供 “区域定制化” 的类器官移植策略，同时为其他神经损伤的类器官治疗提供技术范式。新延伸问题与下一步实验方面，当前研究基于小鼠模型验证效果，下一步需开展大动物（如非人灵长类）实验以验证临床转化潜力；enTsOrg 的长期存活（如超过 6 个月）与成瘤风险需进一步评估；此外，优化 LDH 剂量与释放速率、结合康复训练增强功能整合等，均为后续需探索的方向，这些工作将为 enTsOrg 的临床应用奠定基础。 特色与创新之处一、首次实现胸段脊髓区域特异性类器官的精准构建，突破通用型脊髓类器官的区域匹配瓶颈 现有脊髓类器官（sOrg）多为 “通用型” 模型，仅能复现脊髓的基础细胞组成，无法精准匹配不同节段（颈段、胸段、腰段）的区域异质性，导致移植后难以与损伤位点形成功能整合，尤其对占脊髓损伤（SCI）病例 40% 以上的胸段 SCI 修复效果有限。本研究创新性地通过 “层状双氢氧化物（LDH）生物材料调控 + 分阶段信号诱导” 策略，从成纤维细胞来源的诱导多能干细胞（iPSC）构建工程化胸段脊髓类器官（enTsOrg）：一方面，LDH 通过激活 PTCH1-SHH 信号通路、上调 RA 降解酶 CYP26A1 调控 RA 信号，定向促进胸段特异性神经元分化；另一方面，分阶段添加 LDN-193189（神经外胚层诱导）、RA（尾侧分化）、Purmorphamine（运动神经元诱导）等信号分子，精准模拟胸段脊髓发育过程。最终实现 enTsOrg 中 86.61% 的位点表现胸段脊髓特征，显著高于普通 sOrg 的 65.91%，且胸段特异性基因（HOXC9、HOXB9、HOXD9）表达水平经 qPCR 与免疫荧光验证均显著升高。该创新的核心意义在于：首次建立 “节段定制化” 脊髓类器官构建范式，使类器官能精准匹配胸段移植位点的解剖特征，为解决 “细胞不匹配导致的功能整合效率低” 这一 SCI 修复核心难题提供关键工具。二、创新性开发 LDH-Matrigel 复合支架，实现生物材料对类器官命运的靶向调控与移植微环境优化 传统类器官构建多依赖纯 Matrigel 或基础培养基，缺乏对细胞分化命运的主动调控能力，且移植后易因缺氧、炎症微环境导致细胞大量凋亡。本研究突破这一局限，通过水热合成法制备六边形片状 LDH 纳米材料（直径约 100 nm），并与 Matrigel 按 1:9（v/v）复合形成 LDH-Matrigel 支架：从理化特性看，该支架保留 Matrigel 的 α- 螺旋蛋白结构以维持生物相容性，同时因 LDH 的引入使表面粗糙度提升，显著增强神经元黏附效率；从功能调控看，LDH 不仅能在体外定向诱导胸段神经元分化，还能在移植后通过调控 PI3K/AKT/GSK3β 信号通路增强神经元存活，并通过提升线粒体融合蛋白 MFN2 表达维持线粒体功能、减少氧化应激损伤。体外缺氧模型验证显示，LDH 组类器官凋亡率（12%）显著低于无 LDH 组（28%），证实其对移植微环境的优化作用。该创新的意义在于：将生物材料从 “单纯物理支撑” 升级为 “功能调控载体”，实现类器官分化命运与移植微环境的双重优化，为提升类器官移植存活率与功能整合效率提供新策略。三、建立多维度、高分辨率的类器官功能表征体系，首次证实胸段类器官的成熟电生理功能与神经环路活性 以往类器官研究多聚焦细胞组成与分子表达，对功能成熟度的评估局限于简单的神经元标志物检测，缺乏对电生理活性与神经环路功能的系统验证，难以判断类器官是否具备 “功能性修复潜力”。本研究创新性地构建 “分子表达 - 电生理活性 - 钙信号响应” 的多维度功能表征体系：通过空间转录组测序（ST-seq）明确 enTsOrg 的背腹轴（D-V）基因空间分布（腹侧 NKX2.2+、背侧 Pax2+），匹配体内胸段脊髓结构；采用多电极阵列（MEA）检测显示，enTsOrg 的神经元 spike 振幅、单位时间 spike 数量显著高于 sOrg，网络爆发模式更复杂；全细胞膜片钳记录证实，enTsOrg 神经元的自发动作电位（sAP）频率（1.84±0.44 Hz）是 sOrg（0.56±0.12 Hz）的 3 倍以上，钠电流（INa）峰值（-1004.71 pA）显著更大；钙成像实验进一步显示，enTsOrg 对 KCl 刺激的胞内钙响应（AUC=107.0±5.60）显著强于 sOrg（AUC=95.45±2.96）。该体系的创新意义在于：首次从 “结构 - 功能” 层面证实胸段类器官具备成熟的神经信号传导能力，为判断类器官是否具备 SCI 修复的 “功能基础” 提供量化标准，避免仅依赖分子标志物导致的 “功能误判”。四、系统性验证类器官移植后的神经环路重构，首次实现胸段 SCI 小鼠的双向神经连接与运动功能恢复 多数类器官移植研究仅关注移植细胞的存活与局部细胞整合，缺乏对 “是否形成功能性神经环路” 的直接验证，导致观察到的功能恢复可能源于 “局部代偿” 而非真正的神经环路重构。本研究创新性地通过 “行为学 - 电生理 - 神经示踪” 的系统性验证策略，证实 enTsOrg 的神经环路重构能力：行为学层面，enTsOrg 移植组小鼠 14 周时 Basso 小鼠量表（BMS）评分达 6.5 分，显著高于 sOrg 组的 3.2 分，且步长、步态对称性、水平梯子成功放置率（36% vs sOrg 组 13%）均显著优化；电生理层面，运动诱发电位（MEP）振幅（26.70±8.46 μV）是 sOrg 组（9.62±2.38 μV）的 2.8 倍，证实神经传导功能恢复；神经示踪层面，顺行示踪剂 BDA（注射于运动皮层）可延伸至 enTsOrg，逆行示踪剂 PRV（注射于后肢肌肉）可追溯至 enTsOrg，而 sOrg 组仅类器官内有 PRV 信号、无 BDA 跨界面信号。该验证策略的创新意义在于：首次直接证实 enTsOrg 能与宿主脊髓形成 “双向神经连接”，而非单纯的细胞存活或单向轴突延伸，真正实现损伤区域的神经环路重构，为功能恢复提供核心机制支撑。五、深入解析 LDH 调控类器官命运的分子机制，为类器官优化提供可靶向的信号通路 以往类器官研究多停留在 “现象观察” 层面，对生物材料调控类器官分化的机制解析不足，导致后续优化缺乏明确靶点。本研究创新性地从 “材料 - 细胞 - 通路” 层面拆解 LDH 的调控机制：通过 Western blot、免疫荧光与转录组分析发现，LDH 不仅通过激活 PTCH1-SHH 通路促进胸段神经元分化，还能在移植后通过以下通路增强类器官功能成熟与存活：一是激活 PI3K/AKT/GSK3β 通路，提升神经元抗凋亡能力与轴突再生效率；二是上调泛素 C 末端水解酶 L1（UCHL1）表达，通过泛素介导的蛋白水解通路促进神经元成熟；三是升高线粒体融合蛋白 MFN2 表达，维持线粒体网络稳定、减少氧化应激损伤。同时，通过对比 enTsOrg 与 sOrg 的差异表达基因，发现 enTsOrg 中多巴胺能、GABA 能神经元相关通路显著富集，为理解胸段神经环路的功能协同提供机制线索。该机制解析的创新意义在于：将生物材料的调控作用从 “宏观现象” 深入到 “微观通路”，为后续通过靶向调控 SHH、PI3K/AKT 等通路优化类器官性能提供明确靶点，使研究成果具备可重复、可推广的理论基础。 可以改进的地方[AI基于大数据总结，仅供参考]一、动物模型缺乏免疫健全环境，难以模拟临床移植中的免疫排斥风险不足点分析 该研究采用免疫缺陷型 NOD-PrkdcscidIl2rgem1/Smoc（M-NSG）小鼠构建脊髓损伤（SCI）模型，此类小鼠因 Prkdc 基因缺陷导致 T/B 细胞发育障碍、Il2rg 基因缺陷导致自然杀伤（NK）细胞功能缺失，完全缺乏适应性与固有免疫应答。然而，临床 SCI 患者均具备完整免疫系统，移植异源（如他人 iPSC 衍生）或自体但经体外操作的类器官时，极可能触发宿主免疫排斥反应 —— 包括 T 细胞介导的细胞免疫（如攻击类器官表面的 MHC 分子）、抗体介导的体液免疫，以及巨噬细胞 / 小胶质细胞的吞噬作用。当前研究未评估免疫排斥对 enTsOrg 存活与功能的影响，导致实验结果与临床实际场景存在显著脱节，无法为后续临床转化中的免疫调控策略提供参考依据。例如，研究中 enTsOrg 移植后 14 周的存活率达 90% 以上，但在免疫健全环境下，类器官可能因免疫攻击导致凋亡率升高、功能衰退，这一关键风险未被纳入评估。改进建议引入免疫健全动物模型 ：选用野生型 C57BL/6 或 SD 大鼠构建 SCI 模型，分别移植自体 iPSC（无免疫排斥对照）与异体 iPSC 衍生的 enTsOrg，对比两组类器官的存活时间（通过 STEM121 标记追踪）、凋亡率（TUNEL 检测）及功能整合效率（MEP 振幅、BMS 评分），明确免疫排斥对修复效果的影响程度。模拟临床免疫抑制方案 ：在免疫健全模型中，采用临床常用的免疫抑制剂（如他克莫司、霉酚酸酯）干预，检测不同药物剂量下 enTsOrg 的存活与宿主免疫细胞（CD4+T、CD8+T、CD68 + 巨噬细胞）浸润情况，筛选既能抑制排斥又不增加感染风险的优化方案。类器官免疫原性修饰探索 ：通过基因编辑技术（如 CRISPR-Cas9）敲除 enTsOrg 中 MHCⅠ/Ⅱ 类分子相关基因（如 HLA-A、HLA-DR），或表面修饰抗炎因子（如 PD-L1、IL-10），在免疫健全模型中验证修饰后类器官的免疫逃逸能力与功能保留情况，为临床规避排斥提供技术路径。二、功能评估维度不完整，缺乏对感觉与自主神经功能的系统验证不足点分析 该研究的功能评估聚焦于运动功能（如 BMS 评分、步态分析、水平梯子实验），仅通过 von Frey 与热板实验初步检测机械与热痛觉，未对感觉功能进行系统量化，且完全未涉及 SCI 患者核心困扰的自主神经功能障碍（如排尿困难、排便失禁、体位性低血压）。从病理机制看，胸段 SCI 不仅损伤运动神经环路，还会破坏交感神经节前神经元（位于胸段脊髓侧角）与副交感神经通路，导致膀胱逼尿肌 - 括约肌协同失调、肠道蠕动减慢等严重并发症 —— 这些功能障碍对患者生活质量的影响甚至超过运动障碍。当前研究仅以运动功能恢复作为核心终点，无法全面评估 enTsOrg 对 SCI 的修复价值；同时，感觉功能评估仅检测 “痛觉阈值”，未涉及触觉辨别、位置觉等复杂感觉，也未通过神经示踪（如 CTB 逆行示踪背根神经节）验证感觉神经环路的重构，导致对 enTsOrg 修复 “感觉 - 运动整合环路” 的能力判断不全面。改进建议补充系统感觉功能评估 ： 增加触觉辨别实验（如网格纹理识别测试）、位置觉测试（被动移动后肢并记录小鼠定位反应），量化 enTsOrg 对精细感觉的修复效果； 采用钙成像结合背根神经节（DRG）共培养，观察 enTsOrg 与感觉神经元的突触连接效率； 通过 CTB（霍乱毒素 B 亚基）逆行示踪，检测 enTsOrg 的轴突是否延伸至宿主 DRG，明确感觉神经环路的重构情况。建立自主神经功能评估体系 ： 膀胱功能：采用膀胱测压技术（cystometry）记录膀胱容量、逼尿肌收缩压力与括约肌协同性，通过 HE 染色观察膀胱壁形态（避免长期尿潴留导致的纤维化）； 肠道功能：记录小鼠每日排便次数、粪便含水量，通过免疫荧光检测结肠肌间神经丛中胆碱能神经元（ChAT+）的数量，评估肠道蠕动调控能力； 交感功能：监测小鼠体位变化时的血压波动（体位性低血压测试），通过 Western blot 检测交感神经标志物（如酪氨酸羟化酶 TH）的表达，验证交感神经环路修复情况。三、长期安全性与稳定性数据不足，缺乏对类器官异常增殖与结构降解的监测不足点分析 该研究对 enTsOrg 移植后的随访周期仅为 14 周（约小鼠生命周期的 5%），虽通过 CEA 检测排除短期成瘤风险、通过体积测量显示无明显扩张，但未评估长期安全性与结构稳定性：一方面，iPSC 衍生的类器官可能存在 “潜伏性致瘤风险”（如残留未分化 iPSC），短期内虽无明显肿瘤形成，但长期（如 6 个月以上）可能因细胞异常增殖导致畸胎瘤或其他增殖性病变；另一方面，LDH-Matrigel 支架的长期降解行为未被监测 ——Matrigel 在体内 3-4 周即开始降解，而 LDH 作为无机纳米材料，其长期（如 12 个月）在脊髓组织中的蓄积是否会引发慢性炎症（如异物巨细胞反应）、是否会影响脊髓组织的电生理传导，均未被验证。此外，长期随访中 enTsOrg 的细胞组成是否会发生 “表型漂移”（如胸段特异性 HOXC9 + 神经元比例下降）、与宿主组织的界面是否会形成胶质瘢痕包裹（阻碍长期功能整合），也缺乏数据支撑。改进建议延长长期随访与安全性监测 ： 将随访周期延长至 6-12 个月（覆盖小鼠生命周期的 20%-30%），每 2 个月通过 MRI（7.0T 小动物 MRI）监测类器官的位置、体积与周围组织水肿情况，避免因组织切片导致的样本破坏； 定期取脊髓组织进行 HE 染色、Ki67（增殖标志物）免疫荧光，检测类器官细胞增殖速率，通过全基因组测序（WGS）排查是否存在基因突变导致的异常增殖； 检测 LDH 在脊髓、肝脏、肾脏中的蓄积量（通过 ICP-MS），观察长期蓄积是否引发器官毒性或慢性炎症（如 IL-6、TNF-α 炎症因子检测）。评估类器官长期结构与功能稳定性 ： 每 3 个月通过 ST-seq 检测 enTsOrg 中胸段特异性基因（HOXC9、HOXD9）的表达变化，避免表型漂移； 通过免疫荧光检测移植界面的胶质瘢痕标志物（如 GFAP、NG2），评估是否形成长期结构屏障； 定期进行 MEP 与电生理记录，验证 enTsOrg 的神经传导功能是否长期稳定（而非短期代偿）。四、机制解析深度不足，未明确关键细胞亚型与信号通路的交互作用不足点分析 该研究虽提出 “LDH 通过 SHH、PI3K/AKT 通路调控 enTsOrg”，但机制解析存在两方面局限：一是未明确关键功能细胞亚型——enTsOrg 包含运动神经元（α/γ-MN）、Vsx2 + 中间神经元、GABA 能神经元等多种亚型，研究未通过单细胞测序结合功能抑制（如光遗传学特异性抑制 α-MN），明确 “哪种细胞亚型是运动功能恢复的核心贡献者”，导致对 enTsOrg 修复机制的理解停留在 “群体层面”；二是信号通路交互作用未被解析—— 研究发现 LDH 可激活 SHH 与 PI3K/AKT 通路，但未明确两者的调控关系（如 SHH 是否通过下游 GLI1 激活 PI3K/AKT，或两者为独立通路），也未排除其他潜在通路（如 Wnt、Notch）的参与。例如，转录组数据显示 enTsOrg 中 Notch 通路相关基因（如 NOTCH1、HES1）表达上调，但未进一步验证其功能，导致机制解析不够全面，后续优化类器官缺乏明确的靶向靶点。改进建议明确关键功能细胞亚型 对移植后的 enTsOrg 进行单细胞 RNA 测序（scRNA-seq），结合原位杂交（smFISH）定位，区分 α-MN、γ-MN、Vsx2 + 中间神经元等亚型的空间分布与基因表达特征； 采用 Cre-loxP 系统构建 “细胞亚型特异性光抑制模型”（如 ChAT-Cre 驱动 eNpHR3.0 抑制运动神经元、Vsx2-Cre 驱动 eNpHR3.0 抑制中间神经元），对比抑制不同亚型后 MEP 振幅与 BMS 评分的变化，明确核心功能细胞。解析信号通路交互作用 通过通路抑制剂干预（如 SHH 抑制剂 Cyclopamine、PI3K 抑制剂 LY294002），在体外培养中检测 “单独抑制某一通路” 对 enTsOrg 胸段特性（HOXC9 + 比例）与成熟度（sAP 频率）的影响，明确通路的独立作用； 采用 Co-IP（免疫共沉淀）检测 SHH 通路下游 GLI1 与 PI3K 的 p85 亚基是否存在相互作用，通过双荧光素酶报告基因验证 GLI1 是否结合 PI3K 启动子，明确通路间的调控关系； 补充 Notch、Wnt 通路的功能验证（如 Notch 激动剂 Jagged1 干预），通过 KEGG 富集分析整合所有差异通路，构建 “LDH 调控 enTsOrg 的通路网络”。五、临床转化适配性不足，类器官制备效率与移植方式难以满足临床需求不足点分析 该研究的 enTsOrg 制备流程存在临床转化瓶颈：一是 iPSC 制备周期长（从患者体细胞重编程到 iPSC 稳定培养需 4-6 周），且需严格质控（如排除核型异常），难以满足 SCI 患者 “急性期移植”（最佳移植窗口为损伤后 7-14 天）的需求；二是类器官培养依赖 “超低吸附板 + 摇床培养”，操作复杂且产量低（每 96 孔板仅产 20-30 个类器官），无法实现规模化制备；三是移植方式为 “直接包埋 LDH-Matrigel 液滴”，Matrigel 在体内快速液化（24 小时内），可能导致类器官移位，且手术中难以精准放置到损伤 cavity（缺损区域），无法适配临床中 SCI 患者损伤面积差异大的特点。此外，研究未评估 enTsOrg 对 “慢性期 SCI”（损伤后 3 个月以上）的修复效果，而临床中多数患者因延误治疗处于慢性期，此时损伤区域已形成致密胶质瘢痕，enTsOrg 是否能穿透瘢痕并整合，当前数据无法支撑。改进建议优化类器官制备效率与规模化 探索 “间充质干细胞（MSC）直接诱导类器官”：MSC 来源广泛（骨髓、 adipose），无需重编程，可缩短制备周期至 2 周内，同时通过添加 LDH 与信号分子定向诱导胸段特性； 采用生物反应器（如搅拌式生物反应器）替代摇床培养，实现类器官的批量生产（单次培养产量提升至 1000+），并通过自动化质控系统（如 AI 图像识别）筛选大小均一、活性高的类器官。改进临床适配的移植策略 开发 “可降解支架 - 类器官复合物”：将 enTsOrg 负载于聚己内酯（PCL）- 明胶复合支架（降解周期与类器官整合周期匹配，约 8-12 周），支架设计为 “多孔结构” 以促进宿主轴突长入，同时通过 3D 打印定制支架形状，适配不同患者的损伤 cavity 大小； 探索 “微创移植技术”：采用内镜辅助下的椎管内注射，结合术中 MRI 定位，确保类器官精准放置到损伤位点，减少手术创伤。验证对慢性期 SCI 的修复效果 构建慢性期 SCI 模型（损伤后 12 周），对比 enTsOrg 与 “enTsOrg + 胶质瘢痕抑制剂（如软骨素酶 ABC）” 的修复效果，通过免疫荧光检测瘢痕厚度变化与类器官轴突延伸长度，评估 enTsOrg 穿透慢性瘢痕的能力，为临床覆盖更多患者群体提供数据支撑。 求点赞 求分享 求推荐 如果你想在此显示您的广告信息，请联系我们。 与万千同行共同关注类器官！ 关注我们  肠道类器官（Organoid Bulletin） 本公众号由AI智能体ORGANOID AGENT驱动赋能，您可以直接与公众号对话，获得最专业的类器官知识指导与信息。      我们致力于发布本领域优质资讯与评述，推送国内外类器官与干细胞相关领域最新研究论文、综述与技术进展。发布科普文章、专家观点评论、行业分析、招聘信息和会议通知。您可以在微信、小红书、百家号、企鹅号、今日头条、知乎和Bilibili关注我们。秉承干细胞与类器官创新计划组织(ISCO)愿景，我们积极传播科学知识，促进同行交流，推动产业发展，服务国家战略，积极为类器官与干细胞技术发展提供助力。欢迎各位关注、分享、转载、投稿！原创内容欢迎转载，直接私信即可，完全免费授权。内容多来自学术论文或网络公开资源，如有侵权还请联系删除。 编辑部联系邮箱：zj@organoid.ac.cn 广告赞助 欢迎找到组织 类器官创新计划组织 类器官创新计划组织（Innovations in organoids organization）是由来自中国科学院、北京大学、清华大学和复旦大学等多个顶级研究机构的头部研究团队组织发起的，完全公益的学术与研究技术交流合作组织，成员主要由来自类器官行业内的企业高管、技术经理、高级PI等构成。加入“类器官创新计划”后，您将以极低的成本实现类器官资源的互换与共享，基于肠道类器官和类器官创新计划组织微信公众号平台，您将获得来自全行业的赋能与指导，进行标准化的类器官制备与检测，保证您的研究顺利且高质量开展。我们会将你纳入本组织“技术研发”、“开源公益”和“产品服务”等多个微信群，这样您能够与所有参与计划的成员及时沟通，您所有的类器官问题都能最及时的得到解答和帮助，互换类器官品系和干细胞研究工具资源，解决技术难题，获得技术支持。我们已有上万个来自全国顶级类器官研究机构、大学和企业的注册认证会员，大家一起为类器官事业发展点燃星星之火，推动类器官产业发展壮大。我们还建立了AI知识问答和开源类器官分析工具等多个公益项目为类器官研究提供帮助，构建开放包容的领域生态。在这里,我们敢为人先，始终积极寻求更新类器官更优的解决方案，勇于突破经验与预想的界限，致力打造科学卓越的行业新标准。 官方网站：www.organoid.ac.cn 联系邮箱：info@isco.ac.cn 组织愿景 1.共建开放协作生态：搭建行业资源共享平台，促进技术互通与经验共享，降低类器官研究门槛。 2.引领标准与规范：推动制定行业与国家工程标准，实现类器官培养与应用的规范化、全流程标准化。 3.打造国际级资源枢纽：推动建设全球认可的类器官库与智库平台，加速技术向精准医学与药物研发转化。 4.驱动技术融合创新：推动整合生物材料、智能装备等工程技术创新，突破类器官规模化制备与功能重建瓶颈。 5.强化技术自主可控：推进国产化试剂、仪器研发与技术体系替代，保障核心研发链安全与战略主动权。 加入交流       ISCO面向类器官全领域同行提供交流平台和会员身份认证服务，可以加入“技术研发”、“开源公益”、“产品服务”和“专属领域”等多个类型的交流群，涵盖科学研究技术、开源工具和公益、销售产品与服务、细分领域如类器官芯片、生物材料等专属群等平台，参与讨论。高级研究员或独立PI可以申请成为荣誉发起人，成为类器官创新计划贡献者与受益者。本公益组织目前已有8000+会员，期待您加入讨论分享，让我们共同促进类器官产业发展。      现在，您只需添加发起人微信，备注自己的真实姓名与单位例如“李四-中国科学院大学”，说明申请加入类器官创新计划，提供有效身份证件如学生证、身份证、工作证或其他任何可以证明身份的真实性的证件，即可加入对应社群。而这一切都是公益的，免费的，不收取任何费用。 欢迎您找到组织！~ 扫描二维码添加发起人微信以进群交流 专业收费资源 面向专业科普需求和企业级资源共享，现在扫描二维码加入“肠道类器官”知识星球，就能获得来自顶级研究机构分享的类器官培养基配方和方案，类器官创新计划组织发布的官方标准指南、AI类器官分析工具等更加专业的资料。与1000+位行业精英共同交换类器官技术资料和资源，向行业专家提问，免费参与国内领先的类器官品牌产品内测试用，获得类器官工程师认证等。全行业最专业的类器官知识社区和公益平台，让您的类器官研究少走弯路！ #为什么要加入知识星球？ 1.最新最专业的培养基配方和技术资料即时获取。 2.标准类器官培养方案和技术标准材料发布唯一渠道。 3.最强AI智能体和类器官分析软件和工具解析和下载。 4.类器官领域TOP专家一对一沟通，权威资料触手可及。 5.类器官企业新产品评测和免费试用特权通道。 6.定期发放免费会议入场券和资料，提供演讲机会。  更多福利，请移步知识星球内部了解。 开源公益  类器官能模拟人体器官功能与结构，为疾病研究、药物研发提供有力模型。但分析类器官数据困难复杂，开源算法项目汇聚前沿科学家智慧，让科研人员共享代码，优化数据处理与分析，加速成果转化，推动类器官研究迈向新高度。我们的管理团队和多个科研团队合作，依托类器官创新计划组织，率先开源基于大模型的类器官AI算法工具，未来类器官创新计划组织将不断提供开源免费的类器官分析与报告工具，助力行业快速发展。 #公益知识问答项目Organoid Agent, 采用最新的AI智能体技术，提供超越博士级类器官研究水平和教授级实验技术知识储备。 https://www.coze.cn/store/agent/7376069505418280970?bot_id=true&bid=6fck970447g1k 您还以直接在公众号对话框与它对话，获取帮助。 #开源AI图形算法项目地址 https://github.com/zjdevo/ISCO https://gitee.com/zjdevo/ISCO 开源项目自发起以来，持续受到企业公益赞助,我们感谢以下企业的支持： 上海捷方凯瑞生物科技有限公司  吉诺生命健康控股集团有限公司  如您有意通过赞助公益项目，实现品牌推广与发展，欢迎与我们联系。 扫描二维码添加微信以咨询赞助政策 注册会员      注册会员是面向所有人的公益身份识别项目。如需以组织会员身份获取各种资源与免费福利。您只需访问www.organoid.ac.cn注册会员，并补充个人真实有效身份信息，经人工审核后，即可获得注册会员认证。通过“类器官创新计划组织”和“肠道类器官公众号”的“身份认证”菜单就能找到查询入口。也可以下载专属的身份二维码用于各种需要出示本组织身份的场合如学术会议、合作商提供的免费产品申请。由PI或课题组长及以上级别提供实名信息可注册为“注册会员”，加入“注册认证会员群”优先享受本组织提供的学术界与产业界资源。特别的，您所有的信息仅用于身份识别，不会被进行任何形式的商业用途，     欢迎监督举报（邮箱：isco@organoid.ac.cn）。未进行注册的，不被认为是我组织正式会员，合作方有权拒绝提供任何服务和或产品。 具体注册方式点击下列文章了解： 如何注册成为注册会员？ 扫描二维码快速进入 身份认证系统