国内mRNA企业的递送系统开发策略梳理

2024-01-19

信使RNA疫苗临床3期核酸药物临床1期

IVC2024第四届核酸疫苗与创新型疫苗论坛招商热线：李欣欣 158 0045 2389，扫码咨询限量免费参会入场券：来源：医麦客递送系统对于核酸药物疗效具有关键作用，由于核酸是携带负电荷的生物大分子，很难通过细胞膜的表面带负电荷的脂质双分子膜层，而且RNA容易被血浆和组织中RNase酶降解，被肝脏和肾脏快速清除和被免疫系统识别，进入细胞后需要从内吞体中逃逸到细胞质中。目前进入临床的递送系统主要有脂质体、脂质纳米颗粒（LNP）、脂质复合物、脂质多聚复合物（LPP）以及N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)共轭连接递送系统。外泌体在近年来也开始成为核酸递送系统中的新热点。LNP是目前比较成熟的一个技术平台，用来递送RNA药物、疫苗或基因编辑工具。相对其他类型的核酸药物递送系统而言，LNP具有很多优势，比如核酸包封率高并且能够有效转染细胞，组织穿透性强，细胞毒性和免疫原性低，更有利于递送药物等优势。在5月17日，星锐医药的创始人在Advanced Materials上发表文章题为“Lipid Nanoparticle (LNP) Enables mRNA Delivery for Cancer Therapy”。总结了LNP的开发策略以及mRNA-LNP用于癌症的治疗方法。其中LNP的主要开发策略，包括新型脂质分子的设计和筛选；LNP组分配方优化；LNP表面修饰；给药途径的选择等。目前国内拥有自主研发的LNP递送平台，大多是从以上四种策略研发LNP，或者跳出了LNP框架的新型递送系统。国内mRNA递送系统 eMedClub国内自主研发的mRNA-LNP新冠疫苗递送系统eMedClub在国内拥有自主研发mRNA递送平台的mRNA新冠疫苗企业中，截止目前，还处在临床阶段的有斯微生物 SW-BIC-213（3期）、海昶生物 HC009（1期）、国药中生（1期），蓝鹊/沃森合作的RQ3013（3期）、艾美疫苗LVRNA009（3期）、康希诺（2b期，上市过新冠腺病毒疫苗“克威莎”）等等。近日，国内首个自主研发上市的mRNA-LNP新冠疫苗完成第一针接种，石药集团的SYS6006，而该药的研发晚于斯微、艾博等前沿企业，却能弯道超车完成上市，是由于它的安全有效，并且对多种变异体有效。此前上市的mRNA疫苗中，艾博/沃森合作的ARCoV是当时国内首个mRNA疫苗，最后只在印尼上市。复新医药的復必泰（即BTN162b2）是由BioNTech在国内授权生产的。mRNA的递送避不开LNP专利问题。比如峨巍医药和传信生物就是使用Acuitas授权的LNP专利。国内企业需要绕开专利，可以通过更改专利内阳离子脂质的具体结构或者改变多种脂质的配比来绕开专利的保护范围。石药集团石药集团的SYS6006中，mRNA原料和可电离阳离子脂质由石药集团自主研发内化生产，其他关键辅料如辅助脂质、胆固醇、PEG化磷脂则是实现了国产化替代。▲ 图片来源：官网艾博生物艾博生物自主研发的LNP系统的脂类辅料中含有专利pH敏感脂类，具有优越的递送效率，可保证mRNA在人体内的低毒性和高表达。公司还自主研发了动态精准混合技术，一步反应生成均一分布的纳米脂质球并完成 mRNA 的包裹，包封率高于 90%。研发管线中除了已经上市的新冠疫苗ARCoV，还涵盖了狂犬病疫苗、带状疱疹疫苗等其他传染病疫苗。▲ 图片来源：官网mRNA-LNP新的治疗领域eMedClub目前LNP的靶组织主要局限于肝脏。静脉注射后，80-90%的LNP最终进入肝脏，最终通过低密度脂蛋白 (LDL)受体被肝细胞吸收。通过改变LNP的组分，可以开发器官靶向性的LNP，从而扩大mRNA-LNP的治疗领域。在2022年发表于PNAS的一篇文章“Lipid nanoparticle-mediated lymph node–targeting delivery of mRNA cancer vaccine elicits robust CD8 T cell response+”中，通过改变了LNP的组分，皮下注射mRNA-LNP，实现了淋巴结的靶向。与辉瑞/BioNTech的mRNA疫苗使用的脂质分子ALC-0315相比，ALC-0315以1:4的比例分别靶向淋巴结和肝脏，文中的113-O12B则以3:1的比例分别靶向淋巴结和肝脏。▲ 图片来源：文献2荣灿生物-递送至NK、肺部荣灿生物独立自主知识产权的LNP技术,可以递送CAR mRNA至异体NK细胞，取得了90%以上的递送效率；体内数据显示，对动物实体瘤肿瘤模型抑瘤率近80%。这一实验数据表明了基于mRNA-LNP技术制备CAR-NK细胞药物的有效性及其巨大的开发潜力，并且开发了雾化可吸入的核酸纳米递送载体，成功递送小干扰RNA（siRNA）到达纤维化小鼠的肺部，实现肺纤维化的治疗。 ▲ 图片来源：官网相较于荣灿生物通过LNP递送mRNA至异体NK细胞，目前将mRNA-LNP靶向至体内免疫细胞成为了新的研发方向。国外Moderna、Cartesian Therapeutics、Capstan等公司近两年来开始在mRNA-LNP应用于CAR治疗领域布局，国内如优卡迪、远泰生物等公司也开始加入。优卡迪-递送至T细胞其中，优卡迪虽然递送的是shRNA，但却通过表面负载CD3抗体修饰的LNP载体，递送IL-6 shRNA和CD19-CAR组合质粒，靶向至T细胞，在体内生成IL-6敲低的CD19-CAR-T细胞，从而杀死CD19高表达的白血病肿瘤 CD19高表达的白血病肿瘤细胞，并减少IL-6引起的细胞因子风暴。表面修饰是赋予LNP功能的有效途径。特别是将抗体、多肽或其他分子（透明质酸、适配体、DNA、甘露糖等）偶联到LNP上可以提高其靶向能力。▲ 图片来源：文献3嘉晨西海-组织靶向嘉晨西海开发了包括聚合物和纳米脂质体颗粒在内的一整套RNA递送系统，拥有多个自主知识产权的分别适用于肌肉、静脉、组织靶向给药的阳离子脂复合体。目前针对晚期实体瘤的mRNA-LNP处于1期临床阶段，并且此前用于预防带状疱疹的JCXH-105完成了1期首例患者给药。▲ 图片来源：官网海昶生物-QTsome平台海昶生物具备自主知识产权的QTsome即为新型脂质纳米粒的一种。QTsome向LNP中加入了第五种组分，四价（Quaternary）阳离子脂质。通过引入这种在特定条件可电离的阳离子脂质，利用其对外环境pH的敏感性，最大化核酸药物的负载并促进其在细胞内的递送。基于该平台递送的mRNA，除新冠疫苗之外还涵盖了肿瘤新生抗原的靶点。该平台还用于递送小核酸药物，治疗领域有原发性肝癌和原发性肾癌（临床阶段）。▲ 图片来源：官网突破LNP的创新mRNA递送系统eMedClub除了改变LNP，接下来几家突破了传统的LNP框架，拥有自主研发的新型递送系统。并且还在mRNA新冠疫苗之外的治疗领域布局。斯微生物和康德赛两家都将树突状细胞作为新的靶向，斯微生物的LPP平台用于个性化肿瘤治疗（1期临床），康德赛的Cunde-DC平台用于卵巢癌和肝癌（临床前）。以及瑞吉生物的非载体平台是对mRNA进行了GalNAc修饰。斯微LPP平台LPP (lipopolyplex) 纳米递送平台具有优异的树突状细胞靶向性，可以更好地通过抗原递呈激活T细胞的免疫反应，从而达到理想的免疫治疗效果。LPP 是一种以聚合物包载mRNA为内核、磷脂包裹为外壳的双层结构。LPP的双层纳米粒和传统的LNP相比具有更好的包载、保护mRNA的效果，并能够随聚合物的降解逐步释放mRNA分子。▲ 图片来源：官网个性化肿瘤疫苗管线已经在澳洲开展临床Ⅰ期，并已同步在国内多家医院开展IIT研究，是国内第一家进入临床研究和Moderna、BioNTech 相媲美的个性化肿瘤疫苗。编码细胞因子IL-12的非复制mRNA瘤 IL-12的非复制mRNA瘤内注射剂SW0715的新药临床试验（IND）申请已经获得中国国家药监局药品审评中心（CDE）受理。康德赛DC平台康德赛的Cunde-DC细胞平台，通过分离和富集肿瘤患者的单核细胞，体外诱导为树突状细胞，将肿瘤新生抗原mRNA、相关抗原mRNA、共刺激因子mRNA共同导入自体树突状细胞中，得到高表达个体化mRNA疫苗。不仅可以增加肿瘤特异性T细胞靶向杀伤能力，加快激活免疫系统的进度，还能提高人体的免疫反应，预防后续可能出现的复发。瑞吉生物mRNA GalNAc平台瑞吉的载体平台是GalNAc修饰的mRNA,这是一种基于结合N乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子，结构为mRNA-嘌呤霉素-GBD-GalNAc分子。其中GBD是一种能结合GalNAc的多肽，嘌呤霉素在转录过程中能够结合到核糖体的A位并与正在合成的多肽片段形成肽键并阻止肽段的延伸。此外嘌呤霉素还可以结合到RNA或DNA的3’端。瑞吉此前研发了全球首款冻干型mRNA疫苗，通过调整mRNA-LNP制剂配方并添加冻干保护剂，以及优化冻干工艺，可在4℃和25℃温度条件下保持稳定。▲ 图片来源：文献4mRNA-LNP制备工艺 eMedClubmRNA-LNP生产流程eMedClubmRNA疫苗主要生产流程是：▲获取病原体的基因组测序，再将编码抗原的序列插入到质粒DNA（pDNA）中，并利用大肠杆菌制备得到高纯线性pDNA；▲pDNA在体外被噬菌体聚合酶转录成mRNA；▲将mRNA转录物纯化以去除污染物、酶、游离核苷酸等杂质，以满足GMP生产的质量需求▲将制剂与载体结合。经过纯化的mRNA在微流控混合器中与脂质混合形成脂质纳米粒，以便于体内递送▲利用透析或过滤的方法除去非水溶剂和未经载体封装的mRNA此前纽约时报揭露了辉瑞mRNA疫苗制作的过程，共分为了18个步骤。DNA原液（step1-8）step1：从冷库中提取DNA。从主细胞库中提取新冠病毒的DNA，包含有质粒的DNA小环，也是疫苗的原料，提取后保存在-150摄氏度的小实验瓶中。之后将解冻的质粒注入进一批已经做了人工调整了的大肠杆菌里，从而使大肠杆菌把质粒带入自己细胞里。▲ 图片来源：文献5step2：促使细胞成长繁殖。涵盖了大肠杆菌以及质粒的细胞将会在培养基中生长与繁殖。step3：发酵混合物（细菌）。以上提到的细菌会进行一晚的生长繁殖，然后会被转移至一个拥有300升的营养液里，并且存放四天。在此期间，每20分钟细菌就会繁殖一次，并且复制数以万亿个DNA质粒。▲ 图片来源：文献5step4：采集并净化DNA。发酵过程在经历了四天后，研究员将会往里注入一种化学物质来分解细菌的细胞墙，随后会净化混合物，并且最终提取到仅留的质粒。▲ 图片来源：文献5step5：质量检测。被提取出来的质粒与之前的样品进行对比，以确认刚刚生产的质粒的病毒基因序列并未出现变异，并且能够被用于生产疫苗。▲ 图片来源：文献5step 6：切割质粒。▲ 图片来源：文献5step 7：净化DNA。将以上混合物进行净化，用于滤出任何残留的细菌或质粒片段。会再次测试净化了的DNA的基因序列，并且将其作为下一阶段的模板。▲ 图片来源：文献5step 8：运输。在运输前每瓶DNA都会被冷冻、装袋、密封，并且随时随刻都会被一个小型监控器监视其运输过程中的温度。装有DNA的瓶子会被放入一个装有足够干冰的容器里，以确保所有的瓶子在容器内都会处于-20摄氏度冷冻状态。mRNA原液（step9-12）step9：进行DNA到mRNA的转变。酵素将会撬开DNA模板，获取携带S蛋白基因序列的线性化质粒，通过体外转录（IVT）成为mRNA。其中5´-cap 可以通过在IVT混合物中加入加帽试剂来共同转录。▲ 图片来源：文献5后续需要经过一系列的纯化，除菌等过程。除去酶、游离核苷酸、残留 DNA 和外源 RNA 片段，dsRNA, 及反应体系中的免疫原性杂质。满足 GMP 生产的质量需求。Moderna的mRNA还需要把尿苷替换成假尿苷，以降低免疫原性。▲ 图片来源：文献5step 10：mRNA检测。需要反复测试过滤后的mRNA以确保其出精度以及基因序列是否准确。▲ 图片来源：文献5step 11：冷藏、打包和再次运输。mRNA冷冻到零下20度step12：准备mRNA。收到mRNA的包裹后，保持冷冻直到需要用时。mRNA-LNP（step13-14）step13：准备脂质。step 14：制作mRNA疫苗。将含脂质的乙醇溶液与mRNA的水溶液以1：3，在pH=4的醋酸盐水缓冲液中混合，当脂质与水缓冲液接触时，它们在3:1的水/乙醇溶剂中变得不溶，并且可电离脂质变得质子化并且带正电荷，然后驱动它与带负电荷的mRNA结合，形成脂质颗粒。工业上多采用微流控混合法和冲击式射流混合法进行生产。微流控混合法相对简便快速，条件温和，同时容易实现生产放大。而石药集团以新型交叉流混合装置代替微流控设备，该先进的生产技术工艺过程高度可控，可得到稳定的纳米粒子，重现性更好批间差异小，更易于实现放大和产业化。之后使用切向流过滤（TFF）去除mRNA-LNP之外的所有元素，包括微流控步骤使用的溶剂，并进行缓冲液置换.▲ 图片来源：文献5冻存&制剂（step15-18）step 15：准备疫苗瓶。清洗和高温消毒疫苗瓶线，每一个瓶子都要拍超过100张照片，有裂缝、碎片和其他问题的，都能迅速从生产线踢出去。step16：罐装疫苗。step 17：打包、冷藏和测试。灌注完的疫苗经过检查，贴上标签，然后放进盒子里打包。所有盒子要再冷冻数天，降温到零下70度的温度。与此同时，该批次的疫苗要送去做检测。step18：打包和运输成品疫苗。数周的测试后，合格的疫苗可以运输了。盒子里装上了温度计，实时监测温度是否达标。▲ 图片来源：文献5USP:mRNA疫苗质量分析方法-指南草案eMedClubmRNA技术的快速发展的同时，制定评估mRNA质量的通用方法至关重要，作为药品、食品等相关原料和产品的公共标准制定机构，美国药典（USP）于2022年2月23日发布了题为“mRNA疫苗质量分析方法”的指南草案。为了规范mRNA原料药的质量，USP指南草案提供了大块纯化mRNA原料药的鉴别、含量、物理状态(完整性)、纯度、和安全性的质量属性评估方法，以考察原料药性能相关的质量属性。▲ 图片来源：文献6结语 eMedClub国内mRNA企业已经在递送系统上开始规避国外LNP专利壁垒，凭借自主研发能力，在专利技术上有了突破。核酸药物递送系统目前处于发展初期，而具有功能性的LNP还有很长的路要走。在mRNA领域的竞争中，国内企业已经羽翼即成，即将占据一席之地。参考资料：1.https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.2023032612.https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.22078411193.https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0168365922005387?via%3Dihub4.https://pss-system.cponline.cnipa.gov.cn/retrievezq?prevPageTit=changgui5.https://www.nytimes.com/interactive/2021/health/pfizer-coronavirus-vaccine.html6.https://www.uspnf.com/notices/analytical-procedures-mrna-vaccines-20220210ENDIVC2024第四届核酸疫苗与创新型疫苗论坛招商热线：李欣欣 158 0045 2389戳这里，阅读原文立即领取免费参会入场券