推荐收藏 || 双特异性抗体分子构建

2022-09-07

抗体AACR会议免疫疗法基因疗法放射疗法

摘要过去的20年间，治疗性双特异性抗体（双抗）得到了长足发展。“双抗家族”其结构形式已多达100种，这其中包括不同种属之间的组合。最简单的双抗分子即包含两个可分别特异性结合抗原位点的小分子（抗体重链，轻链可变区序列）。还有IgG样分子以及由可以结合不同的抗原位点的大分子复合体形成的二聚体分子。复杂分子设计和基因工程的应用已经解决了许多关于双抗制备的技术难题，比如：稳定性、溶解性以及其它关于成药性抗体分子的相关参数。这些参数总结起来讲即抗体分子的可开发性。另外，不同的产品开发目标，决定着所产生的双特异性抗体的特征，指导着所需要形成的双特异性抗体的结构形式，以及开发过程中可能需要改变它们的结合区域的分子大小、排列、价数、柔韧性和几何结构。因此，不存在最佳的双特异性抗体结构，也不存在某个结构形式普遍适用于任何双特异性抗体分子。相反，双特异性抗体结构形式的多样性才是宝贵的资源，才有可能成就治疗性双特异性抗体的百花齐放。本文将综合描述绝大部分双特异性抗体的形式。前言双抗在疾病诊断治疗方面越来越受到关注，双抗能够同时识别相同或不同抗原的两个不同抗原表位，而天然抗体只能识别一个抗原表位。双抗有着相对久远的历史，始于上世纪60年代，当时就能够将两个来自血清中的多克隆抗体的不同的抗原结合片段(Fabs)重新组合成双特异性F(ab’)2分子。1975年杂交瘤技术的建立巩固和加强了双特异性抗体的理念，这使得产生真正意义上的双特异性抗体成为可能，早期双特异性抗体的构建思想是通过化学偶联的方式将两个单克隆抗体铰链起来，或者通过将两种杂交瘤细胞株通过融合的方式产生杂交杂交瘤细胞。随着重组抗体技术的发展，使得生产具有特定的结构、组成、生物化学性质、功能和药理学特性的双特异性抗体成为可能。双特异性抗体广泛用于诊断、影像、疾病预防和治疗。起初，双特异性抗体在治疗领域的应用主要集中在效应细胞靶向肿瘤细胞的重定位，这其中就包括T细胞的重定位，这一点，靠传统的单克隆抗体是无法实现的。过去的几十年里，建立了基于双特异性抗体的多种治疗策略。除了重定位的效应分子，细胞和基因治疗载体，双靶向，前靶向策略，半衰期延长，以及跨越生物屏障比如血脑屏障的方法已经被开发了出来。双特异性抗体被认为是众多适应症中最具潜力的治疗手段，包括癌症，慢性炎症反应，自身免疫性疾病，神经退行性疾病，出血性疾病，感染等疾病。这些分子的使用已经有广泛的报道。本文将集中描述产生双特异性抗体的众多结构和相应的策略。双特异性抗体无疑是发展最快的领域。随着新的结构形式不断涌现，紧跟脚步实在是一项挑战性的任务，本文不可能面面俱到，也不可能囊括现存所有的双抗结构样式。对双抗结构样式的探索，相关知识的学习不能一蹴而就，任重道远。双特异抗体的分类绝大多数天然抗体是针对同一抗原结合位点二价或者多价分子。IgG4分子由于其铰链区的不稳定，通常会发生Fab臂交换的现象。这是一个随机的进程，该过程产生针对两个特异性位点的双价分子。而双特异性抗体是针对两个明确的特异位点产生的人工分子，通常在自然状态下是不能发生的。这就意味着需要借助生物化学，分子以及遗传学方面的知识，经过改造才能实现。最为古老的方法是化学偶联的方法将两个抗体分子，或抗体分子片段强拉硬拽的连接了起来，本文不做赘述(CovX-Bodies) 图2-1。另外，通过融合两种杂交瘤细胞，在新的杂交-杂交瘤细胞里产生含有两条不同重链，两条不同的轻链双特异性IgG分子，如图2-1，同时也产生一些非功能分子副产物。产生IgG样的双特异性分子其难点在于抗原结合位点由轻链和重链的可变区序列（VL,VH）共同组成。一个双特异性抗体需要两条不同的重链，两条不同的轻链以非对称的形式组成，并至少含有两个Fv区。两条不同重链，两条不同的轻链自由组合的结果多达16种，产生10种不同的分子结构，却只有一种想要的双特异型结构。其余都是一些非功能性分子或者单抗分子。对于双特异性抗体来说，直接，有力的完成重链与重链，重链与轻链的组装，的确是一大条挑战。二十多年来，人们通过各种策略，一致致力于解决这个问题。重组双特异性抗体可根据结构和组成进行分类。一大主要的区别在于双抗分子是否含有Fc区。不含Fc区的双抗分子缺少Fc介导的效应功能，例如抗体依赖的细胞毒性作用（ADCC），抗体依赖的细胞吞噬作用（ADCP）,补体的固定，FcRn介导的抗体循环（将大大延长IgG的半衰期）。含有Fc区的双特异性抗体可进一步分为IgG样的分子以及额外包含其它结合位点的IgG样衍生物。不同的双特异性分子又可根据对称性分为对称结构和非对称结构。例如，多数IgG样双特异性分子为非对称的，而IgG样融合蛋白在组成上通常是对称的（图1）。进一步的可以根据结合位点数目区分它们的特点。在一简单的设计中，像IgG分子一样，双特异性抗体包含两个结合位点可以针对各自的抗原表位即“1+1”形式，是双价的。在IgG的基础上，给每一条链增加额外的结合位点形成4价分子，即“2+2”形式。其它的形式包括产生“1+2”或者“1+3”等分子结构，拥有1个结合位点结合一种抗原的一个表位，和2或3个结合位点分别结合另外的抗原。可以通过增加价位，或者增加特异性产生3或4价分子。另外，产生双特异性抗体链的数量可以多样化。因此，典型的IgG样双特异性抗体需要表达四条不同的多肽链，但是在某些结构中仅需要3,2,甚至一条链就可以实现。图1 模块及产生同源或者异源二聚体分子实例示意图一个广泛的囊括了不同模块 ———抗原结合分子，可以用于产生同源或异源二聚体双特异性抗体分子的示意图（图1），可根据设计靶点分子，价位，分子大小，灵活性，药代动力学和药效学特性等需求来设计双特异性抗体。图2.双特异性抗体分子结构总览缺少Fc的双特异性抗体形式串联连接单链可变区片段（scFv2,taFv）和三体最简单的双特异性抗体，由两种抗体的抗原结合片段构成。单链可变区片段scFv形式源自VH,VL,代表着最小的抗原结合单位，是最为广泛的双特异性抗体构成元件。由于scFv的构象，双特异性抗体可以通过将两条scFv用连接子连接而成。因此，这些分子是双价的，对于每一个抗原来说又是单价的，其典型的分子量在50-60KDa。首次关于串联scFv分子的报道要追溯到20年前（如图2-3）。在这项研究中，两个scFv通过27个氨基酸的螺旋连接子或柔性连接子（木霉菌脱氢酶I）连接融合表达。自此以后，许多串联表达的scFv结构相继报道。原则上，两个串联的scFv形成taFvs，其排列顺序是明确的（VH-VL或VL-VH）,连接子的长度和组成影响着taFvs的折叠，稳定性，以及与抗原的结合。各种各样的连接子可以用来连接两个scFv, 最短的连接子如Ala3,通过噬菌体展示筛选到的亲水性连接子，富含Gly-Ser的连接子，采用螺旋构象的连接子以及一些源于免疫球蛋白和非免疫球蛋白的分子。由5和15个氨基酸长的Gly-Ser连接子，连接两个分别针对CD3和CD19有活性的scFv片段，构成的连接子不同的两种双特异性抗体，体外实验显示二者之间在生物活性上没有差异，这就意味着短的连接子连接的scFv有足够的柔韧性，可以募集T细胞并交联到肿瘤细胞展示的抗原。串联scFv的双特异性抗体广泛应用于肿瘤免疫治疗，重定向T细胞到肿瘤细胞或肿瘤微环境中的肿瘤相关细胞。这一结构形成重定向T细胞的双特异性抗体分子(BiTE)，第一款(BiTE)双特异性抗体分子(Blincyto, blinatumomab)获准用于治疗费城染色体阴性前体B细胞急性淋巴细胞白血病(B-cellALL)患者, blinatumomab由CD19抗体的scFv按VL-VH方向通过G4S连接子连接着以 VH-VL 排列的CD3抗体scFv。由于分子量小，BiTE分子可以快速的被清除，半衰期仅1.25h。该抗体治疗需要用注射泵以恒定的流速持续静脉注射，治疗至少持续4周。串联scFv双特异性抗体包括针对CD16 的scFv,重定向NK细胞的双特异性抗体（BiKEs）。在一项研究中，抗CD16 scFv由源于人肌肉醛缩酶的20个氨基酸连接子连接抗CD133抗体scFv用于结肠癌治疗。这种模块化方式的构建特性允许拓展串联scFv，例如添加更多的scFv。即应用于产生三价抗体，双特异性分子（三体）含有两个CD19结合位点和一个CD16结合位点重定向与NK细胞（如图2-3）。该三体中所有scFv单位，可变区结构域VH和VL结构域，所有连接方向为VL-VH，通过 20个氨基酸的(G4S)4连接子连接而成。该方式允许产生三特异性分子，就如同现实的三价分子，三特异性三体分子针对CD16,CD19,CD33,多靶向针对混合白血病细胞表面的不同抗原，重定向NK细胞到癌细胞周围。单个scFv模块的稳定性是一个普遍关注的问题，因为分子间的相互作用只发生在VH-VL界面之间，它们之间没有共价键。串联scFv稳定性的改善需要在scFv单元的VH结构域和VL结构域引入二硫键（在VH 44位和VL 的100位引入Cys）产生二硫键稳定的scFv(dsFv,dssFv)。这种方法也可以引入三价甚至多价抗体中，稳定1个，2个，甚至所有的scFv单元。另一种方法是在VH和VL结构域中引入氢键（VH39,VL38）以替代靠静电引力维持的VH-VL相互作用。双特异性结构域抗体融合蛋白串联排列抗原结合位点，单结构域抗体例如VH或VL结构域，VHH,VNAR和纳米单抗，都可以用来构建双特异性抗体分子，而且，这些方法也可以用于支架蛋白，产生抗体样蛋白（如图2-3）。包含2个或更多个单结构域抗体将在一个或多个特异性分子中，产生双价，三价或更多价分子。例如两个VHH结构域通过一个长的铰链区序列融合起来，该连接子源自美洲驼IgG2a铰链区上游不易被蛋白酶降解的序列或柔性序列。另一个例子是柔性连接子将两个鲨鱼免疫球蛋白新抗原受体（VNAR）连接起来。该连接子由天然鲨鱼免疫球蛋白新抗原受体铰链区氨基酸组成（PGVQPSP），随后是柔性GGGGSG序列。在另一项研究中两个人源单域抗体，结合为双特异性抗体DAbs,该双特异性抗体靶向白色念球菌的两种抗原。例如一个实例中产生的四价抗体，由连接子将四个VHH连接成双特异性VHH融合蛋白，两个VHH靶向TcdA,两个VHH靶向TcdB,(这两种抗原来自艰难梭菌属)，在四个VHH分子之间由三个柔性连接子(G3S)4连接。体内外实验显示该融合蛋白都加强了中和作用。纳米抗体可以结合形成三价，双特异性分子，再连接一个血清白蛋白以延长血清半衰期，另两个位点靶向目标抗原。一个针对IL-6R的纳米抗体融合蛋白目前已进入临床实验。这里有一个由三个纳米抗体通过两个GGGGSGGS连接子连接的融合蛋白。类似的方法，三价双特异性VHH融合蛋白用于口蹄疫病毒治疗，融合猪免疫球蛋白，显著增强了融合蛋白的体内半衰期。双体和双体衍生物双体（Db）是由两条链构成的双价分子，每条链包含一个VH结构域和一个VL结构域，两条链上的VH和VL来自两个不同抗体。在双体形式中，两个可变区结构域通过5个氨基酸残基的短连接子连接，例如GGGGS。实质上由于其连接子长度，较抗原结合位点形成的scFv链内组装所需要的连接子短，两条链以从头对尾的方向二聚化产生紧凑的分子，分子结构类似于串联的scFv,分子量约50Kda。在同一个细胞中表达两条链，一条为VHA-VLB构型，另一条链为VHB-VLA构型（A和B代表两种不同的特异分子）或者以VLA-VHB和VLB-VHA构型产生可变区正确配对的异二聚化的双特异性抗体（图2-3）。双特异性抗体已经被用于重定向效应细胞，效应分子，以及其他用途。比如抗表皮生长因子抗体EGFR与抗胰岛素样生长因子抗体IGF-R构成的双特异性抗体，结果显示，选择优化的VH/VL排列方向在一定程度上影响着抗体与抗原的结合。除了结构域的顺序，连接子的长度，组成都需要经过优化。研究表明抗神经氨酸酶scFv在以VH-VL,VL-VH两种取向，连接子为3-12个G-S的连接子连接的情况下易于组合成双体，当连接子更短的时候将产生三聚体，四聚体的组装。关于双特异性双体分子的一个问题是,两条不同的链,VHA-VLB和VHB-VLA共同表达于一个细胞，容易产生非正确配对的可变区结构域（VHA/VLB,VHB/VLA）。进一步的问题是由于两条链之间并非共价键连接，稳定性较差。一种解决方法是在配对的VH-VL结构域(dsDb)之间引入二硫键（图2-3）该方法可以增加稳定性。该方法进一步改进是在两对VH-VL配对中都引入二硫键，另外在VHA-VLB连接中仅用长度为10个氨基酸的连接子，而VHB和VLA分开来单独表达，于是产生了含有三条多肽链的dsFv-dsFv’结构（图2-3）.另外也可以尝试新的模型用于不同的结构域形成异二聚体。例如，形成knob-into-hole双特异性双体（图2-3）.该方法的一个实例是抗表皮生长因子受体HER2与抗CD3抗体构成的双特异性双体。该结构是在一个配对的VH与VL之间不同的位点引入突变，显著增加了异二聚体的形成。当然，在某些情况下，这样的突变形式容易影响抗体与抗原的结合，这就意味突变位点要慎重选择。另一种可替换的方案是以形成单链的形式，改变形成异二聚体双体的方法，将形成双体的第一条链(VHA-VLB or VLA-VHB)，和第二条链(VHB-VLA or VLB-VHA)通过15个氨基酸的柔性连接子连接起来。这一单链形式的双体分子中(scDbs)，长连接子保证了两条链的正确组装，在不改变抗原结合活性的前提下，提高了分子的稳定性。scDb由四个可变区结构域通过三个连接子连接而成，两个侧翼连接子和一个中间连接子。后来其他scFv中的组装中也用到了该连接子。已经有研究者借助噬菌体文库筛选，就连接子在长度和氨基酸组成上进行了优化。研究发现，在单链双体形成过程中，两个侧翼的连接子以2-6个氨基酸长度最为适宜，中间的连接子以＞13个氨基酸更为适宜。其它适宜作中间连接子包括源于核蛋白La C端结构域中的α螺旋序列。单链双体结构scDb有时候也用作产生四价双特异性抗体。这可以通过缩短中间连接子使得两个scDb多肽链形成头对尾的二聚体分子，串联双体(TandAb)(图2-3)其分子量大约在100KDa,两倍于scDb的分子量。在以CD19和CD3抗体组成的TandAb中，中间连接子用6-12个氨基酸。这一产生TandAb四价体的方法也被成功用于重定向与NK细胞的CCD16A抗体和CD33抗体组成的TandAb四价抗体上。在该构造中用了由9个氨基酸，包含3个GGS重复的三个连接子中。该TandAb（AFM13）已经用于复发或难治性霍奇金淋巴瘤治疗的临床1期试验中。在另一TandAb构造中，针对CD33和CD3的抗体，三个连接子分别用了GGSG, GGSGG, GGSGGS。关于双体的形成，另一种方式是在两条链得C端加上Cys。通过该方法形成的双体称作双亲和重定向蛋白(DART)（图2-3）.该结构的第一个实例是针对CD32B和CD16两个分子。每条链的VL结构域与VH结构域之间通过8个氨基酸GGGSGGGG连接，第一链的C端以源于IgG1铰链区上游序列FNRGEC或LGGC进行延伸，第二链的C末端以VEPKEC（源于κ链C端）或LGGC进行延伸。所有修饰产生稳定的，二硫键连接的分子，并且保持着相应的抗原结合活性。该结构也用于构成CD19 X CD3双特异性抗体。运用双体形式，产生四价双特异性分子之前已经描述过。在一个实例中，额外的一个VHA融合在了VLA-VHB的N端，而且与多肽链VLA-VHA-VHA共表达，运用富含GS的16个氨基酸残基连接额外的可变区到双体核心上（图2-3）.在该研究中，四价双特异性形式由VHA-VHA-VHB和VLB-VLA-VLA构成，所有的VH结构域在一条链上，所有的轻链VL结构与在另一条链上呈现。在每一条链前两个结构域C端分别通过16,14个氨基酸的连接子连接，而前两个结构域之间通过GGGGS连接子链接。两种三头分子（BS6,BS8）都可以在大肠杆菌中表达产生有活性的分子，可能用于向肿瘤细胞递送放射性标记的二价半抗原。Fab融合蛋白Fc缺乏的双特异性抗体也可以以Fab为基础构建，以及与其他单元融合。Fabs是由一条轻链和一条重链片段Fd组成的,并以此产生双价，双特异性分子。也可以通过在轻链,或者Fd的C端融合scFv,产生三价，双特异，三特异融合蛋白(bibody Fab-L-scFv, Fab-HscFv),甚至是在两条链的C端都融合scFv,产生三体(tribody, Fab-(scFv)2)（图2-5）。在另一个例子中Fd链包含5个铰链区上游氨基酸EPSGP，scFv通过DVPSGPG或(G4S)3连接子融合在L和Fd链的C端。这项研究表明Fab中的VH和VL结构域极大增强了CH1-CL-介导的异二聚化和分泌。所有形式在双特异性结合中都是完全有效的，被描述为在生理条件下具有低聚集和稳定的倾向。对于其他scFv融合蛋白，将scFv连接于L链或Fd链的连接子，以及L链，Fd链上，以及scFv上供连接子连接的结构域顺序都可以用来调整功能性分子柔韧性。例如，三价双特异性Fab-scFv 和 Fab(scFv)2融合蛋白已经用于针对CD19和CD16的抗体。在这里，scFv使用VL-VH的顺序，该scFv含有结构域间二硫键，起稳定作用，而且通过GVPGGS连接子融合在Fab部分。在另一个例子中，借助二硫键稳定的scFv的通过(G4S)n连接子融合到Fab产生单价的针对cMET的结合。在Fab额外融合一个或两个额外的结合位点产生双价，三价的分子。拓展Fab部分到铰链区将产生四价的F(ab’)2-scFv融合蛋白，以对称形式共价连接在铰链区（图2-6），如抗右旋糖酐/丹酰双特异性抗体。通常，该方法还可以用于融合单结构域抗体或支架蛋白到Fab上，例如产生的Fab-H-VHH融合蛋白靶向HER2和CD16.Fabs也可以通过在其C端借助柔性连接多肽(替代铰链区)连接产生强的异二聚化Fab样部分。这种产生TriFabs，双价，双特异性融合蛋白包含三个功能性Fab单元（图2-9）.TriFabs包含两个调节性Fabs,作为异源二聚化模块，通过20个柔性的氨基酸多肽连接子(G4S)4融合而成，产生非对称的Fab样抗体。随后的VH融合一个包含一个Knob（T366W）突变的CH3和一个VL结构域融合一个含有Hole(T366S, L368A,Y407V)的CH3,通过Knob与Hole完成配对。为了增加稳定性，在可变区的主干区域通过域间二硫键起到稳定作用(H44-L100)。整个结构类似于IgG,只是Fc被主干区域替代。在TriFabs中缺少二硫键，进一步可以通过在CH3结构域(S354C-Y349C)引入二硫键得到补偿。不同的双特异性TriFabs表现出不同的功能，例如在茎干区针对地高辛或生物素，Fab臂针对CD33,GPC3或LeY.的双特异性抗体。Fab-Fab融合蛋白可以通过将第一Fab臂的Fd链与第二Fab臂的Fd链的n端融合产生，产生一个由VHA-CH1-linker-VHB-CH组成多肽链，单独表达两条轻链（图2-5）.然而，两条轻链可以随机的与Fd链，产生四种不同的分子，只有一种是双特异分子。为了使同源的轻链与相应的Fd正确组合配对，可以引入一些突变。这其中的一个例子是，利用正交的Fab,已经产生了双特异性Fab-Fab融合蛋白，该蛋白靶向于EGFR和CD3,重定向效应T细胞到表达EGFR的肿瘤细胞。有趣的是，与串连连接的scFv相比，Fab-Fab融合蛋白增加了热稳定性。串联的scFv更具有杀伤肿瘤细胞的潜力，很有可能是分子量相对较小的scFv影响着效应细胞与靶细胞之间的距离，以及免疫细胞形成的免疫突触。Fab也可以作为异源二聚化的模块结合第二个特异性的VH和VL结构域。这一般用于产生Fab-Fv融合结构，一般将VH融合在Fd链的C端，将VL融合在轻链的C端（图2-5）。为了稳定融合的Fv结构，在链间引入二硫键（H44-L100）产生Fab-dsFv分子。这些结构增加了Fab的半衰期，直接靶向相应的抗原，Fv部分可以结合血清蛋白。Fab-dsFv分子具有在生理条件下稳定，保留了针对两种抗原的亲和力，在小鼠和食蟹猴体内试验中，展示了良好的药物代谢动力学特征，其效果类似于PEG化的Fab’.除了使用Fab,重组T细胞受体TCR，包含α,β胞外域组装成Fab样结构，可以结合与MHC-展示多肽复合物。重组TCR通过融合scFv也可以用作产生双特异性分子的结构，例如借助于TCR β链通过接入柔性连接子融合scFv，构建成双特异性抗体。这些双特异性分子(ImmTACs)（图2-6）可以通过TCR识别肿瘤细胞，通过融合的scFv靶向CD3分子重定向效应T细胞。对于增加TCR的α，β链异源二聚体的稳定性来说，需要在α,β链的C端引入二硫键。其它缺乏Fc的融合蛋白缺乏Fc的抗原结合蛋白scFv的异源二聚化需要借助二聚化的多肽（图2-6）.异源二聚化多肽多种多样，包括包含螺旋-螺旋的亮氨酸拉链结构，来自于Jun和Fos蛋白中的二聚体“拉链”肽融合到Fab’分子或scFv分子中，通过jun,Fos同源二聚体还原、重组、再氧化等方法形成异源二聚体。在另一种方法中，两种不同的scFv通过双螺旋模体连接，组装形成四螺旋束，最终产生四价的双特异性分子。IgG的CH1和CL结构域也可以用作形成异源二聚体，双特异性scFv融合蛋白（图2-4）。靶向EGFR和CD2的scFv分子通过IgG1的CH1和Cκ结构域形成scFv-CH1/scFv-CL融合蛋白异源二聚化分子。CH1和CL结构域通过自然的二硫键共价连接，形成稳定的异源二聚体。选择不同长度，柔性连接子将scFv的N端与CH1或CL相连。CH1-CL异源二聚化模块进一步产生双特异性单结构域抗体融合蛋白（图2-4），该结构已成功用于重定向与NK细胞的CD16抗体和靶向癌胚抗原CEA抗体的双特异性抗体的构建。以铰链区序列进一步延长CH1，形成scFv-CH1-hinge/scFv-CL异源二聚化蛋白，产生四价的双特异性分子（图2-17）。这一结构用于靶向HIV gp41抗体和重定向中性粒细胞IgA受体（CD89）抗体的双特异性抗体构建。双价的scFv-CH1/scFv-CL融合蛋白和四价的scFv-CH1-hinge/scFv-CL融合蛋白，观察到明显的抗体依赖的细胞介导的病毒抑制作用，但是串联的scFv可以靶向同样的抗原，但是未观察到病毒抑制活性。到目前为止，我们描述的是将抗原结合蛋白直接融合或运用免疫球蛋白衍生物产生异源二聚化结构的双特异性抗体。然而，非免疫球蛋白样的异源二聚体模块也可以通过不同的结合位点，以共价或非共价的形式形成异源二聚体。其中一个例子是称作dock-and-lock的方法（DNL）,该方法利用cAMP依赖的蛋白激酶（PKA）的调节亚基与A蛋白酶锚定蛋白的锚定结构域（AD）之间形成异源二聚体完成组装的策略。在这里，锚定结构域AD由23个氨基酸组成可以跟第一个结合位点融合，由一个长44个氨基酸的二聚化的DOCK结构域（DDD）融合第二个结合亚基。这一策略将形成三聚体复合物，即一个与AD融合的蛋白，两个DDD融合蛋白结合形成三聚体，还可以在AD与DDD之间引入二硫键，使他们之间通过共价键相连。这一设计产生双特异性，三特异性抗体的可行性已经得到了论证。三价DNL-Fab3融合蛋白可以直接靶向癌拍抗原CEA和组胺琥珀酰甘氨酸（HSG）。两种融合蛋白（DDD通过14个氨基酸连接在抗CEA抗体Fab的CH1 C端，另一个结构是将AD结构域融合在抗HSP抗体Fab的CH1 C端），将这两种蛋白单独表达，然后结合在一起，产生两个位点结合CEA，和一个位点结合于HSG的双特异性抗体，可应用于靶向前药的放射性治疗。DNL方法可进一步产生Fab2-scFv分子（图2-6），将scFv融合在AD结构域，可适用于多种特异性抗体包括CD19,CD20,CD22,HLA-Dr,MUC5AC,Trop-2,和IGF-1R结合抗CD3抗体重定向T细胞，显示出该方法的灵活性。另外DNL可以用于产生六价体，双特异性IgG-Fab4融合蛋白。其他可能用于产生双特异性抗体的非免疫球蛋白异二聚模块的例子包括barnase-barstar系统，适配子/锚定标签模块（基于突变的RNase I片段），SNARE模块基于与三种蛋白突触融合蛋白，小突触泡蛋白，SNAP25的相互作用，进一步产生二元系统。白蛋白是血浆蛋白，缺少抗体样效应功能，但是具有与IgG分子类似的可结合FcRn再循环产生的半衰期。两个scFv和双特异性抗体分子融合白蛋白结合产生双特异性融合白蛋白样，具有白蛋白样特征（图2-6）。因此将两个不同的scFv与人血清蛋白(HSA)融合，一个连接在N端，一个连接在C端，充分的延长了scFvs的半衰期。类似的，将串联的双特异性scFv或者scDb,与白蛋白融合，产生相似的功能（图2-6）。利用该方法产生scFv-HSA-scFv融合蛋白，将靶向HER2和HER3的scFv ,融合进修饰的HAS(C34S, N503Q),产生均质性很好的融合蛋白，以短的多肽连接子AAS,AAAL分别连接在HAS的N端和C端。当然，其他多种蛋白可以融合产生双特异融合蛋白，例如一些毒素，细胞因子，趋化因子，生长因子，结合双特异性抗体产生双靶向具有效应功能的融合蛋白。其他抗原结合位点移植到scFv最简单的双特异性抗体由抗原结合位点scFv构成，将其修改为包含第二个结合位点，作为scFv的组成部分。因为免疫球蛋白折叠需要β-片层连接而成，尝试将互补决定区(CDRs)嫁接到scFv的底部，以生成双特异性分子(χsFv)。尽管这一方法没有进一步用作双特异性抗体的开发，相关的方法将抗原结合位点嫁接在CH3的底部，这一原理也可以用于其它结构域，例如将抗原结合位点嫁接在CH1-CL的底部形成Fab。图3.不同轻重链链的组合形式以及轻重链错配解决策略表1.Fc异源二聚化设计IgG样非对称双特异性结构所有双特异性IgG分子，双特异性抗体有别于自然的免疫球蛋白，拥有双价和非对称结构，至少含有不同的Fv区域。重链和轻链的准备与起源的不同，它们还可能在重链或轻链的恒定区域有所不同。非对称样IgG包含来自两个不同抗体的重链和轻链融合两个杂交瘤细胞系，产生杂交-杂交瘤(quadroma),该细胞产生两种不同抗体重链和轻链的结合。产生的双特异性抗体由第一抗体的重链和轻链与第二抗体的重链和轻链构成（图2-2）。两个抗体重链，轻链可以是相同的亚型，类型，也可以是不同的亚型，类型。两个抗体也可以源自不同的种属，该方法产生三功能性抗体。小鼠源杂交瘤与大鼠杂交瘤融合产生双特异性，非对称结构的杂交IgG分子（图2-2）。描述了重链与轻链的择优配对。重要的是，异质性的Fc部分，可以通过proteinA亲和层析分离纯化，杂交IgG分子可以在PH5.8的条件下进行洗脱。进一步的，表达不同重链和轻链的细胞系可以通过基因工程的手段实现。基因工程手段允许不同的重链和轻链可以采用不同的人抗体类型组成，甚至允许引入一些突变。如同后续讨论部分所述，允许在重链和轻链中引入突变以便异源重链之间正确的组装以及促进同源重链和轻链完成正确组装，同时特定的基因工程改造还可以促进正确组装的双特异性抗体的纯化。IgG样非对称双特异性抗体借助Fc解决重链配对问题在下面的章节重点介绍基因工程手段解决重链异源二聚化的问题。异源二聚化的重链仍旧可以结合不同的轻链，产生四种类型的抗体，但只有一种双特异性分子，一种非功能性分子，两个单克隆抗体。运用重链异源二聚化的方法将四条多肽链随机组合形成的10中分子降低到了4种（如图3）。重链的配对借助于最后一个保守结构域。天然IgG分子中CH3结构域介导两条重链的配对，二者之间亲和力达KD~10 pM，借助两条重链的CH3，两条相同的重链形成同源二聚体。进一步的相互作用发生在铰链区，两条重链之间通过二硫键共价连接，这也是我们后续要提到重链异源二聚体组装所借助的最主要的作用力。在IgG1重链形成同源二聚体中，两条重链CH3界面相互作用涉及16个氨基酸残基，核心氨基酸残基包括T366, L368, F405, Y407, 和K409，对同源二聚体的稳定起着举足轻重的作用。过去的20年里，发展出了各种各样的策略包括空间的，静电转向，或者各种设计的组合，以及形成链间二硫键，总之，最终是为了产生互补的界面以克服同源二聚体的形成。受Crick等人在关于两条α螺旋氨基酸包装过程中提出的Knob-into-hole技术的启发，Ridgway和他的同事将这一技术引入相互作用的CH3界面，在一条重链的CH3引入小分子量的氨基酸产生一个Hole，在对侧的CH3作用界面引入较大的氨基酸产生一个Knob,通过尝试不同的突变，最终确定了适宜形成异源二聚体的突变，在一个CH3做T366Y突变，在另一条CH3做Y407T突变。这一Knob-into-hole突变最先用于抗HER2抗体与抗IGF-1R抗体形成的IgG样双特异性抗体上。Knob-into-hole策略进一步通过噬菌体展示技术得到了改进和完善，这些突变很快就被用于产生IgG样双特异性抗体（图2-7），并且还尝试了引入额外的二硫键加强Knob-into-hole技术产生的异源二聚体的稳定性。其中一个优秀的突变为在一条CH3做S354C, T366W突变，在另一条CH3做Y349C, T366S, L368A, Y407V突变（表1）。这一异源二聚体形成策略随后就用到抗Mlp和抗HER3双特异性抗体的构建中。由于两个抗体含有相同的轻链，因此可以表达共同轻链，异源二聚体产生了功能性双特异性抗体，可以通过proteinA纯化，同时抗体具有Fc介导的ADCC作用。Knob-into-hole技术很快得到了广泛的应用，现已成为通用的双特异性抗体产生策略，而且借此衍生出了更多的理论和结构，包括三价IgG样抗体，双特异性Fc，及双特异性CH3融合蛋白。应用的另一个例子是T细胞重定向双特异性抗体，为了避免由于双价CD3抗体系统性的激活T细胞，借助双特异性抗体，用单价的CD3抗体与T细胞结合。这包括用scFv-Fc（KIH）,即在每个Fc的N端连接着一个scFv。tandem-scFv-Fc(KIH) (BiTE-KIH)即将串联的scFv连接在一条Fc上（图2-9）。在该研究中，CD3抗体部分可以融合在含有Knob的Fc上（KIH）,也可以融合在含有Hole的Fc上（KIHr）,有趣的是BiTE-KIHr在表达滴度上胜过BiTE-KIH，然而在靶向T细胞激活，以及肿瘤细胞裂解上没有区别。类似的一个方法，利用Fc-KIH产生双价双特异性scFv-Fc融合蛋白，该蛋白靶向CD16和HER2,用于招募NK细胞到肿瘤细胞周围。单价结合在一些抗体结合细胞表面受体是必要的，例如c-MET,为了避免由受体偶联引起的激活。双特异性抗体以单价的形式结合与细胞表面受体，主要应用于双靶向结合中和不同的受体，一般通过融合Fab臂到含有Hole的Fc N端，在同一条Fc的C端融合上二硫键稳定化的scFv，共表达一条含有Knob的非融合Fc链（图2-9）。将VH结构域融合在Fc(kih)的C端，将VL结构域单独表达或者融合在Fc(kih)另一条Fc的C端产生双特异性，三价IgG-Fv (mAb-Fv)融合蛋白，Fv可以借助链间二硫键稳定（图2-8）。将Fv融合进IgG形成IgG-Fv,该融合过程中还可以引入蛋白酶酶切位点，例如在Fv中的VL融合进Fc过程中引入furin 或 MMP酶切位点（图2-8）。经过酶切，产生Fc端仅含有VH结构域连接于IgG的双特异性抗体。类似的，产生了一个scFv-Fc-Fv融合蛋白，含有两个EGFR结合位点（scFv融合进Fc的N 端），一个LPS抗体的VH结构域融合进含有Knob的Fc C端，VL结构域融合进含有Hole的Fc C端（图2-9）。进一步借助KIH技术衍生的双特异技术包括TriMAbs。在该技术中，一个或者两个二硫键稳定化的scFv融合进Fc(KIH)中的一条或两条链，形成三特异性，三价或四价抗体（图2-8）.已有TriMAbs抗体靶向EGFR,IGF-1R和/或 cMET和HER3。在该方法中Fab为单链Fab构成，伴随二硫键稳定化的Fv结构域形成scFab-Fc(kih)-scFv2，scFab-Fc(kih)-scFv。最近，knob-into-hole技术拓展到IgG其它亚型，产生IgG4异源二聚体，该抗体缺乏Fc介导的效应功能，例如产生针对IL-14和IL-13的双特异性抗体。运用基于结构和序列的策略，开发出CH3界面的多种配对策略，一种突变产生CH3二聚化，该突变称作HA-TF突变(S364H, F405A /Y349T, 394F)。利用该突变将mAb-Fv (IgG-Fv, mAb-Fv)形式的异源双特异性分子形成率提高到了~83%。利用该方法开发出了双价针对HER2,单价针对CD3的异源二聚化三价双特异性抗体。进一步的利用CH3异源二聚化模块包括单价和双价scFv-Fc融合蛋白。另一种基于结构的合理设计是包括一系列的突变，据报道这些突变体使异源二聚化Fc有很高的热稳定性，而且未检测到同源二聚体的形成。Fc(ZW1)突变设计包括T350V, L351Y, F405A, 和Y407V 的第一链突变，包含T350V, T366L, K392L, 和 T394W的第二链突变，产生双特异性的IgG, 包含共同轻链（图2-7，表1）。ZW1策略主要依赖与疏水作用力，另一种异源二聚体的形成策略是利用静电转向的策略来避免CH3结构域的同源二聚化，经过突变产生一条带正电荷的CH3和一条带负电荷的CH3,通过静电引力形成二聚体。在野生型的CH3中发现了两条链中K409和D399之间的电荷作用。于是将一条链的CH3 K409突变为D,另一条链CH3 D399被突变为K,该K409D/D399K突变非常适宜形成CH3异源二聚体。在一条链CH3中引入K392D,另一条链中引入E356K突变将产生专一性的异源二聚体，运用以上两种突变结合，产生K409D, K392D / D399K, E356K突变更利于形成异源二聚体，该策略已经用于针对CD3和TARTK scFv-Fc形式的双特异性融合蛋白的构建（图2-9），最近，该方法也用于产生针对EGFR和HER2或针对硬骨素和DKK-1 IgG样双特异性抗体的构建。这包括在Fab臂内引入电荷配对提高了轻链的正确配对。静电转向作用也用于Biclonics，该双特异性抗体用了共同轻链技术和异源二聚化重链策略。在该双特异性抗体中，在一条链CH3中（366,366+351）被带正电的赖氨酸K来替代，在第二链的CH3(349,351,355,368)被带负电荷的谷氨酸E或带负电荷的天冬氨酸D来替代（表1）。利用该技术产生的针对HER2,HER3的双特异性抗体MCLA-128已进入临床1/2期。优越的重链异源二聚化策略也包括在IgG1和IgG2铰链区引入带电氨基酸（图2-7）。例如IgG1,将第一链的铰链区采用D221E, P228E替代，在第二链铰链区采用D221R 和P228替代（表1）。对于IgG2,第一链的铰链区采用C223E,P228E替代，第二链采用C223R,E225R,P228R替代（表1）。在这里，由于E225R可以与第一链的E225有静电引力，所以在IgG2第一铰链区仅需要突变两个点。结合L368E和 K409R，形成在第一链C223E,P228E,L368E,第二链C223R,E225R,P228R,K409R突变，产生异源二聚体的组装。运用该方法产生了针对EGFRxHER2的IgG样非对称结构双特异性抗体，也产生了针对CD3Xcd20的IgG样双特异性抗体，运用单独表达双特异性抗体中的半抗体，最终由半抗体组装成完整的双特异性抗体。另一项研究，突变向着有利于两条链之间形成疏水作用力的方向进行。将两条链中疏水作用核心氨基酸L351, T366, L368, Y407向着疏水作用更大或更小的氨基酸，取代对称的静电引力，形成非对称的疏水作用力，第二，取代那些弱电作用的氨基酸，以长链带电氨基酸形成长距离的静电作用。其结果最终形成了第一链CH3K360E, K409W突变，第二链CH3Q347R, D399V, F405T突变，即CH3 (EW-RVT)形式（表1）。以此策略形成了针对VEGFR-2和MET的scFv-Fc异源二聚化双特异性抗体，具有很好的生物学功能（图2-9）。向以上的突变中引入二硫键（第一链引入Y349C,第二链引入S354C）将增加该异源二聚体的形成，并相应增加了其热稳定性。另外，通过酵母展示系统筛选Fc结合库，不同的Fc突变经过筛选，将异源二聚体的形成率提高到了80%-90%。基于观察到的IgG4抗体天然的Fab臂交换动态发生在两条单独的重链组装成完整IgG4的过程中。Fab臂的交换主要归因于核心铰链区序列与CH3区域内的残基结合。这一天然发生的IgG4 Fab交换引入IgG1,通过控制Fab交换形成稳定的IgG1双特异性分子(cFAE)。通过筛选CH3结构域的突变控制Fab交换，在第一抗体中引入K409R突变，在第二抗体中引入F405L突变，这些突变允许两种单独表达抗体混合后，在存在β-met(β-巯基乙醇)还原性环境的条件下发生Fab链交换，形成双特异性抗体。利用该方法产生的抗EGFRxCD20双特异性IgG(DuoBody)(图2-7)，产生＞95%的双特异性分子。CH3界面的互补性允许异源二聚化Fc的组装可以通过链交换工程化结构域（SEED）形成异源二聚体（表1）。链交换工程化CH3结构域可以选择来自人IgA的CH3与IgG 的CH3交换（AG SEED CH3 和GA SEED CH3），产生SEEDbodies。由于该分子模型研究发现AG SEED CH3降低了与FcRn的相互作用，通过改变CH2-CH3连接的氨基酸残基将恢复IgG与FcRn的相互作用。药代动力学研究表明SEEDbodies的半衰期与IgG1类似。SEEDbodies的实例包括双特异性的Fab-scFv-Fc和scFv-Fc融合蛋白靶向EGFR的两个抗原表位的双特异性抗体（图2-9）。该双表位抗体具有两种单抗类似的结合力，但生物活性增强了。另外跟CH3异源二聚化类似的结构有自然T细胞受体中α，β亚基形成异源二聚体。该技术可以用做基于TCR的双特异性抗体构造(BEAT)（表1），可以应用于产生Fab/scFv-Fc融合蛋白，而且，可以同时解决了轻链错配的问题（图2-9）。该方法已用于产生针对HER2和CD3的双特异性抗体，起到重定向T细胞的作用。Leaver-Fay和他的同事应用多级设计（MSD）,该方法设计多种蛋白层级，同时产生一组CH3突变。两组突变实例(7.8.60 and 20.8.34)（表1）广泛用于产生双特异性抗体，运用该法产生的IgG样双特异性抗体由pertuzumab (anti-HER2),matuzumab (anti-EGFR), BHA10 (anti-LTbR),和 MetMAb(anti-cMet)衍生而来。结合orthogonal Fab相互作用界面的突变，产生高达93%双特异性抗体分子。重链的异二聚化组装也可以通过使用一个单独的异二聚模块来实现，该模块随后从双特异性抗体中移除。该方法应用于产生亮氨酸拉链结构的异二聚化，基本操作是在两条重链的C端分别融合Acid.p1 (Ap1) 和 Base.p1 (Bp1)多肽。该LUZ-Y平台产生单价的Fab-Fc融合蛋白，也可以产生含有共同轻链的双特异性IgG抗体，或者产生scFab,该scFab针对EGFR和HER3(图2-7)。在Fc的C端引入蛋白酶酶切位点和亮氨酸拉链结构，通过蛋白酶水解可以切除脸氨酸拉链，产生自然状态的双特异性IgG抗体。图4.IgG样双特异性抗体产生策略组装后纯化的方式产生双特异性抗体以上描述的策略都是基于修饰产生异源重链配对完成重链的组装，其他一些突变引入Fc区将有利于纯化异源二聚化抗体。后组装水平类似于Triomabs策略（如图4）.Fc引入的突变有利于ProteinA亲和层析纯化。例如源自IgG3相应氨基酸位点的替代，H435R,Y436F,将IgG1Fc的一条链做H435R,Y436F替换产生Fc*，该突变废除了与ProteinA的结合（如图2-7），因此，产生的Fc*- Fc*同源二聚体不能与proteinA亲和层析柱结合，而含有异源的Fc Fc*双特异性抗体与proteinA亲和力减弱。然而ProteinA也可以结合源于VH3家族基因的VH结构域，这将会干扰FcFc与Fc Fc*二聚体的分离。这一问题可以通过proteinA衍生物Z-domain得到解决，这一结构不能与可变区结合，可以将异源二聚体从同源二聚体中分离。另一种使用后组装纯化策略的方法是使用共同重链，不同的轻链，在这一形式的分子中给定的重链可变区VH结合不同的轻链可变区VL形成对不同抗原的特异性。因此非对称结构仅存在Fab臂。该策略用于k/λ bodies，该方法需要表达三条多肽链，一条重链，两条轻链（1条κ轻链，1条λ轻链）（如图2-2）。含有共同重链VH的结合位点可以通过共有VH域文库进行筛选，也可以筛选含有相同重链VH的两个抗体，或者已有抗体的VH,随后结合不同的轻链筛选特异性结合抗原的抗体。需要注意的是一条轻链需要为Vκ另一条为Vλ。这一策略已用于多种人类抗原双特异抗体的构建，意味着这一技术可以推广使用。共同重链和共同轻链共表达与同一细胞，随后的双特异性抗体需要三步色谱纯化（1）第一步用IgG-ch1捕获选择柱或ProteinA亲和层析，2）κ链选择柱，3）λFab亲和层析。这一方法无需对重链和轻链进行基因改造，产生天然的双特异性抗体。然而，产率相对于突变产生的异源二聚体抗体产生的错配分子多的多，其错配率高达50%。利用基因工程的方法解决非对称抗体中轻链错配问题利用修饰迫使重链异源二聚化，解决了重链错配的问题，这些策略也可以用于轻链解决轻链的问题。因此，采用两种不同的轻链将产生四种不同的结合，只有一种分子是双特异性分子。很多方法都已开发出来，结合Fc修饰（总结如表1），用于解决同源重链，轻链正确配对的问题（总结如表2）。第一种用于解决轻链问题的方法是共同轻链。这一方法的基础在与观察到通过噬菌体文库筛选针对不同抗原的抗体时，经常会出现轻链相同的现象，这反应了轻链的噬菌体库非常有限。结合重链的knob-into-hole技术，产生了针对HER3和Mpl的IgG样双特异性抗体。各种各样的含有共同轻链的IgG样双特异性抗体相继出现，比如以knob-into-hole为基础的修饰，以及其他的Fc修饰方法用于轻链。虽然还未用于产生双特异性抗体，但这也是共同轻链可选择的一种策略。Surrobodies基于Fab,运用替代的轻链，该替代轻链由λ5结构域融合VpreB结构域而成。结合文库以surrobody形式筛选针对各种抗原的抗体，例如利用该方法差生的双靶向DR4,DR5的抑制性抗体，因此，该方法也可以用于产生双特异性抗体。之前描述的一些Fc修饰运用scFv融合Fc的方法产生双特异性抗体来规避轻链的问题。基于Fab可以通过单链衍生物的形式表达（scFab在轻链的C端与重链的N端相连，在一条单链上表达Fab）的发现，全长IgG分子可以通过轻链连接重链形式的单链来表达，连接子用30-38个氨基酸(G4S)6，删除CH1与CL连接的二硫键位点。一个改进的scFab平台包含60个柔性氨基酸的连接子，包含二硫键稳定scFab。(G4S)6连接子，结合Fc的knob-into-hole突变可用于产生Fab-Fc融合蛋白，该结构可进一步修饰，通过C端融合scFv,形成三特异性，三价和四价分子（图2-7,2-9），该方法实例有针对EGFR,IGF-1R,cMet或HER3抗体，利用一个Fab,和一个串联的scFab臂，针对不同位点的两个scFab（图2-8）。scFab也可以结合LUZ-Y Fc异源二聚化策略（图2-7）。另外，蛋白酶酶切位点引入Fab连接，这就意味着通过酶切水解可以将连接子从正确组装的IgG双特异抗体上切除连接。另外单链scFab可以结合未修饰的Fabs产生双特异性Fab-scFab-Fc融合蛋白，结合Fc(KIH),形成OAscFab-IgG形式。以该形式产生的针对EGFR和IGF-1R的双特异性抗体，而且该双特异性抗体有很高的表达量。表2. Fab臂异源二聚化CrossMab代表着另一种策略。该技术中联采用了Knob-into-hole技术，通过一条Fab上重链和轻链的互换位置产生CrossMabFab，或者只交换一条Fab中配对的VH和VL位置,形成CrossMabVH-VL，或者交换一条Fab中重链和轻链恒定区的位置CrossMabCH1-CL（图2-7）。例如由CrossMab技术产生的针对VEGF和Ang2的双特异性抗体，CrossMabCH1-CL形式的双抗显示亲和力保持不变，副产物要少的多。在随后的研究中A2V抗体可以重编程巨噬细胞，大量的颅外肿瘤模型中，显著延长了生存期。由该技术产生的抗体RG7716, RO6867461目前已进入临床。最近CrossMabCH1-CL形式用来产生针对HIV膜蛋白 CD4/CCR5的双特异性抗体来中和病毒。当然，起初CrossMabs也可以观察到一些副产物，这是由于未修饰的轻链错配产生的，后续可以通过引入额外突变而改进。CrossMabs已发展为一个通用性的平台技术，不仅可以用于产生双价，双特异性IgG分子，也可以产生三价，四价双特异性IgG融合蛋白。例如在Knob-into-hole 的重链N端融合Fab,或者CrossMab的两条同源二聚化重链的C端融合两个Fab(图2-1,8).CrossMab技术还可以用于其他形式抗体，包括双特异性，三价和四价的IgG-Fab融合蛋白，例如产生的一个双特异性分子一个结合位点结合CD3,另两个结合位点结合肿瘤相关抗原。进一步产生四价，四特异性4 in1抗体，通过运用Knob-into-holeFc区，和CrossMab技术产生2 in 1的Fab臂。另一种解决轻链问题的方法是利用基因工程的方法改变轻链和重链相互作用的界面产生正交的相互作用，让轻链以高亲和力结合与通院的重链（表2）。该方法主要解决可变区VH-CL的相互作用，对CH1-CL相互作用进行必要的修饰。尝试各种各样多层面的突变设计进行比较鉴定。有一组突变适合于正交的Fab。这些修饰用于产生多种IgG样双特异性分子例如针对EGFRxcMET,EGFRxHER2,Axl xcMET,EGFR xLTβR,以及利用两种HER2抗体trastuzumab和pertuzumab抗原结合位点形成针对两个HER2不同表位的双特异性抗体。还有一些实例中Fc的异源二聚化通过静电作用转向实现。例如一个双特异性抗体中正交的Fab用了pertuzumab (anti-HER2) 和 matuzumab(anti-EGFR),两个抗体的轻链类型都是λ型，pertuzumab抗体重链进行了Q39K, R62E, H172A, F174G 取代，轻链进行了D1R, Q38R, L135Y, S176W 取代(VRD1CRD2修饰) ，结合matuzumab 抗体重链Q39Y 和轻链Q38R的取代(VRD2修饰）产生了高达90% 轻链正确组装。进一步的直接作用于轻链与同源重链Fd配对的策略涉及对Fab臂中重链恒定区CH1和轻链恒定区CL的替换，分别用TCR的Cα,Cβ结构域替换。这已经用于产生Fab-IgG 样分子，Fab臂融合在重链的N端，以(G4S)5 连接子连接，也可以产生IgG-Fab分子，Fab臂融合在重链的C端，以(G4S)4 连接子链接，例如由trastuzumab和pertuzumab 产生的双特异性抗体（图2-1）。然而由于trastuzumab 抗原结合位点VH/VL强烈的相互作用，仅有少量Fab正确配对，这一现象在VL引入Y36F 突变，弱化了VH-VL的相互作用得到了改善，另外，通过在VL和VH引入静电相互作用VL Q38D, VH Q39K 也能达到弱化VH-VL相互作用的目的（表2）。CH1-CL配对突变，进一步丰富了三价Fab-IgG 融合蛋白的内容。基于3D结构模型与能量角度的考虑，对两种突变进行了测试。方法一(CR3) ，配对相互作用的极性氨基酸突变为中性和盐桥形成氨基酸，重链CH1 发生T192E 突变，轻链CL发生N137K突变，作为补充，在轻链用丙氨酸取代S114以避免与较大的赖氨酸侧链发生空间冲突。第二种方法基于疏水性-极性互换(MUT4) ，重链和轻链都发生两个点突变，重链CH1做L143Q 和S188V 突变，轻链做V133T 和S176V 突变（如表2）。体外测试中方法一（CR3）突变显示了超级活性，主要归因于双特异性抗体更好的稳定性，最高的功能活性。在DuetMab 方法中，Fab臂正确配对，主要通过替换CH1-CL天然的二硫键，形成新的替换二硫键。比较了众多的突变，鉴定出重链CH1 F126C突变结合轻链S121C,产生高达98%的双特异性分子（表2）。结合Fc的knob-into-hole技术将产生各种各样的IgG样双特异性抗体。例如针对EGFR和HER2,或者针对CD4和CD70的双特异性抗体，该结构产生高纯度，高活性的双特异性抗体分子（图2-7）。半抗体生产后组装解决轻链问题以上提到的通过基因工程的手段解决不同重链和轻链正确组装的问题，所有的组装都发生在同一个细胞中。然而，也有可能将构成双特异性抗体的两个半抗体分子（一条重链和一条同源的轻链）单独表达后再进行组装形成双特异性分子（如图3，4）。这样，在重链Fc引入突变修饰就足以向着有利于形成异源二聚体的方向发展，或者通过ProteinA或proteinG 亲和层析后在进行组装，完全有利于形成异源二聚体。这一概念已经在Fc含有knob-into-hole,不含铰链区的IgG样双特异性抗体模型上得到论证。两个半抗体分别在E. coli 中表达，随后通过proteinA及其他色谱纯化，然后将两条半抗体复性产生双特异性IgG分子。该方法进一步的改进措施是将两个表达半抗体的E. coli 共培养。通过裂解菌体，两个半抗体释放，组装成完整的双特异性抗体，该方法已经在抗EGFR和抗MET抗体形成IgG样双特异性抗体中得到验证。产生相应抗体的两种E. coli 克隆需要调整到最佳比例。因此，经过尝试anti-MET:anti-EGFR 的比例以60:40最为理想。最后通过ProteinA亲和层析，疏水作用力层析纯化去除半抗体。共培养方法很重要的一点是祛除了氧化还原步骤。该方法已经用于抗IL13xIL4,或抗HER2xCD3的双特异性抗体中。这种中和抗体无需ADCC作用以及其他Fc介导的效应功能。表达后组装策略可进一步用于铰链区，以及CH3结构域（IgG1 (EEE - RRR) 和IgG2 (EEE -RRRR) 含电荷配对的突变体组装成双特异性抗体的过程中（表1，图2-7）。两种抗体可以单独的在HEK293细胞中表达，并通过proteinA亲和层析纯化，然后将纯化抗体置于温和的还原环境中产生半抗体，随后将两种半抗体等摩尔混合，在温和的还原条件下，37℃孵育过夜。用哺乳动物表达系统可以产生糖基化修饰且未改变Fc效应功能的抗体，该方法也适用于产生Knob-into-hole IgG样双特异性抗体。非对称性Fc及CH3融合蛋白以上提到的Fc修饰可以用于产生双特异性Fc或CH3融合蛋白，已经有多种实例报道。各种不同的结合模块，scFv,Fab,scFab单元等，都已经用于双特异性抗体构建。在每条Fc上融合两种针对不同靶点的scFv，产生双价的双特异性scFv-Fc融合蛋白，拥有IgG的特征。该策略还可使用前面提到的Knob-into-hole Fc区，CH3结构域电荷配对的异源二聚化Fc,以及EW-RVT修饰的Fc（图2-9）。另外，一个Fab可以结合一个scFv,例如每个异源二聚化的Fc的N端融合一个scFv，产生一个Fab-scFv-Fc 融合蛋白（图2-9）。该方法已经用于BEAT Fc修饰。这种方法的一个变体是用CH3结构域形成异源二聚体，例如形成双特异性的scFv CH3融合蛋白（图2-9），例如利用该方法产生的一个双价双特异性融合蛋白minibody,该融合蛋白将一个anti-HER2 scFv 融合在一条CH3结构域的N端，将一个anti-CD16 scFv 融合在另一条CH3的N端，在两条CH3的C端引入二硫键，进一步稳定CH3二聚化结构（图2-9）。进一步的异源二聚化的Fc区域可以用来将两个结合位点融合进一条Fc，另一条Fc不做融合，然后将两条Fc共表达（图2-15）。例如一个双特异性Fab-Fc-scFv 融合蛋白，将anti-Met Fab 融合进含有hole突变的Fc N端，将anti-digoxigenin 二硫键稳定化的scFv融合进含有hole突变的Fc C端,与另一条未融合含有knob的Fc共表达，形成异源二聚体。在一项研究中，双特异性串联的scFv融合在Fc的N端，产生双特异性，双价融合蛋白。在另一项研究中，产生了一个DART-Fc 融合蛋白，将DART分子的一条链融合进带有knob突变的Fc N端，然后将其与带有hole的未融合Fc 以及DART的另一条链共表达。还有一种方法是利用knob-into-hole二聚化的Fc,将DART一条链融合进带有knob突变的Fc ，然后将另一条DART链融合进其与带有hole的Fc，两条链靠DART的二硫键共价连接替代铰链区的连接。该DART-Fc融合蛋白正在开发用于T细胞重定向的CD3双特异性融合蛋白的开发。为了避免Fc引起的功能效应，引入了效应缺陷的Fc。这些用于形成双特异性，双价抗体特性的方法可以结合一些延长半衰期的策略一起使用。对称结构的双特异性抗体IgGS附加体：scFv融合蛋白融合额外的结合位点到重链或者轻链是最直接解决重链和轻链随机配对问题的办法。这需要将额外的结合位点以一条多肽连的形式表达。而且这条多肽连不允许与主体抗体的重链和轻链发生相互作用。scFv最适宜做融合搭档，,而不是单域抗体和支架蛋白。这一基于IgG的附加体拥有对称的结构和四个价位与抗原结合，针对每个抗原含有两个结合价位，可以通过四条多肽连完成表达（图1）。该方法首次报到是1997年，Coloma 和Morrison1将anti-dansyl scFv 融合进anti-dextran 的重链CH3的C端，或者铰链区的C端。一个短小的连接子G3S 连接在重链C端和scFv 的VH结构域的N端。共表达anti-dextran 的轻链，产生一个IgG-HC-scFv (CH3-scFv) 或F(ab’)2-scFv2(Hinge-scFv)融合蛋白，该结构包含四个结合位点（图2-10，16）。该双特异性融合蛋白IgG-scFv 的分子量达到200KDa, F(ab’)2-scFv2 分子量为150KDa。该双特异性抗体结合两个抗原，偶尔会碰到scFv亲和力的降低。该方法的进一步衍生是在抗体的重链（图2-1）或轻链（图2-11）的N端融合一个scFv，产生scFv-HC-IgG, scFv-LC-IgG ，或者在重链和轻链的N端都融合一个scFv,产生scFv-HC/LC-IgG （图2-12）。在Fv区引入二硫键会改善分子稳定向，减少聚集。该融合蛋白维持高水平表达，热稳定性，耐蛋白酶切。他们同时保留了Fc的效应功能和类似于IgG的半衰期。融合一个scFv到IgG轻链的C端也可以产生功能性双特异性抗体IgG-LC-scFv ，许多这样的抗体保持稳定性并且具有与正常IgG相同的特性。在某些抗体中，重链和轻链之间分布着二硫键。因此，IgG重链和轻链的末端都可用于产生附加体，双特异性分子。进一步研究显示，在重链或轻链的N端或者C端融合串联的scFv可以产生三特异性抗体。进一步的想象包括构建多价分子，包括三，多特异性抗体，可以在抗体的重链和轻链融合相同或不同的scFv分子，尽管有可能会影响结合点对抗原的结合，但经过优化和筛选，可以达到预期的目标。在重链的CH1融合一个scFv,在轻链的CL一端融合另一个scFv可以产生一个四价体，四特异性抗体scFv4-Ig，在恒定区的两端含有四个scFv分子（图2-12），这种方法起初用于产生双特异性靶向VEGF两个不同抗原表位的双特异性抗体构建，后来也用于双靶向于肿瘤细胞的anti-EGFR x anti-IGF1-R 双特异性抗体构建。同样的形式也可以用于EGFR 特异性scFv结合anti-CD3 scFv 双特异性抗体构建，重定向T细胞到肿瘤细胞。比较该结构的双特异性抗体与等价的scDb-Fc 融合蛋白，表现出最高的细胞毒性。然而由于其200KDa的高分子量，重组蛋白的产量很低，因此scDb-Fc 融合蛋白综合来讲，更有优势。IgG scFv 需要考虑的一个关键问题是连接scFv到IgG的连接子。连接子必须稳定且具有理想的柔韧性，并且不能与scFv以及抗原IgG结合结构域发生相互作用。将scFv融合进IgG轻链或重链的C端不能影响IgG与抗原的结合。然而，在一些连接在N末端的scFv会封闭掉IgG与抗原的结合位点。典型的IgG-scFv 融合蛋白连接子是2-3个重复的G4S. 。其它一些连接子包括一些亲水性的螺旋连接子，例如SNS(EEAKK)3SNS 已经用于将scFv融合在重链C端的连接中。短连接子可能有能力维持抗原结合，最近三个残基的连接子GSS已经成功应用于靶向HER2 X HER3 IgG-HC-scFv 构建中。进一步的，scFv天然的稳定性可能受工艺的影响。因此为了优化scFv的稳定性，使用更长的连接子（20个氨基酸残基）连接VH和VL结构域，并且筛选适宜的位点引入二硫键以加强二者的相互作用。结合长连接子，并在VH44和VL100之间引入二硫键，稳定scFv。在anti-LTbR scFv 实例中，使用该策略提高了其热稳定性13℃，运用该策略产生的anti-TRAILR2 x anti-LTbR IgG-scFv 双特异性抗体以及scFv-IgG 融合蛋白都具有理想的药用开发价值。二硫键也可以用于改善双特异性IgG-scFv 和IgG-HC-cFv 的稳定性。为了提高anti-digoxigenin-specific scFv 的稳定性，在VH Cys44与VL Cys100 之间形成二硫键。将其融合在不同的特异性抗体，包括HER2,IG1-R, CD22, 和LeY 的重链C端或者铰链区。以上的构造中scFv由两个重复的G4S 连接子连接在重链的C端，所有的抗体保持了亲和力和特异性。所有的双特异性抗体稳定性都很好，未见蛋白聚集。这一策略随后用到其它抗体，包括cMet, HER1, HER2, 或 HER3 。连接子长度的影响，也在HIV受体CCR5两个不同位点的表位双特异性抗体IgG-scFv 融合蛋白中得到研究。3-6个重复的G4S 连接子在非二硫键稳定的scFvs中也打得到了研究。用长达30个氨基酸残基的连接子链接scFv，其稳定性跟母本抗体类似，但是在引入二硫键稳定的scFv中使用了15个氨基酸长度的连接子。借助噬菌体文库筛选更稳定的scFv可以部分解决scFv稳定问题的局限性，早期关于这方面的研究见于anti-IL17A x anti-IL23 双特异性IgG-scFv 融合蛋白的研究中。最后抗体的筛选基于对scFv两种连接方式VH-VL 和 VL-VH 的检测，SEC-MALS检测组分稳定性，扫描量热法评估单体的热稳定性综合筛选各项性能最优的分子。类似的，稳定性优化的scFv已经用于产生靶向IGF-1R不同表位的双特异性抗体构建，将scFv融合在IgG的N端或C端。IgG scFv融合蛋白可以发挥Fc介导的效应功能，包括吞噬,ADCC，补体固定，该效应功能依赖于不同的抗体亚型和结构形式。例如，在一些应用中双靶向和中和细胞受体的抗体不会摧毁靶细胞，这个时候携带缺陷型Fc的IgGs更具优势。因此，一个完整的无效应功能的Fc区域，可以通过去糖基化的IgG4.P/IgG1 恒定区嵌合体来替代，这一结构已经用于构建IgG-HC-scFv 样融合蛋白，将稳定性优化的抗IGF-1R 的scFv融合在anti-EGFR IgG 上。其它关于无效应功能的Fc包括一些Fc的突变，或者由IgG2和IgG4衍生而来的嵌合体。在过去的几年里，各种不同的双特异性IgG-scFv 融合蛋白已经构建用于肿瘤治疗，在双靶向，抗体药物穿越血脑屏障递送，前靶向放射性免疫治疗领域都有应用。IgGs附加体：融合抗体结构域和支架蛋白作为一种scFv的选择，单域抗体已经用于产生生特异性IgGs附加体分子。例如，抗PDGFRa 的单可变区结构域通过5个氨基酸(ASTKG) 的连接子连接在anti-VEGFR-2 IgG 轻链的N端，保持了两种抗体的抗原结合活性和中和作用（图2-11），该方法随后拓展，在重链的C端融合了一个单结构域（图2-10）。随着各种各样的支架蛋白开发为抗体的替代物，于是有了更加多样的机会，将支架蛋白融合在IgG的重链或轻链，产生双特异性IgG附加体分子。一个实例是Fynomers ，分子量只有7KDa的球蛋白，该蛋白源自人Fyn 激酶SH3结构域，该蛋白缺乏二硫键，但是非常稳定，熔解温度达到70℃。将该蛋白融合在抗HER2抗体pertuzumab 的重链或轻链的N端或C端，产生双特异性分子(FynomAbs) ，具有中和HER2介导的肿瘤细胞增殖的能力。基于这些发现，另一个FynomAb ，COVA322 ，在抗肿瘤坏死因子TNF药物Humira 上融合抗IL-17A Fynomer ,COVA322 目前应用于银霄病临床试验1b/2a期。相关的支架蛋白使用包括特异性的多肽，他们也可以用作与IgG融合产生双特异性分子。该策略已应用于Zybody 技术（图2-12）。例如一个Ang2 特异性多肽通过6个氨基酸残基的Gly-Ser 连接子连接在anti-TNF IgG (adalimumab) 重链的C端。Zybodies 产生高达5种特异性结合位点，一个识别位点来自于IgG,其余多达四个结合位点来自于融合的识别结构域模块，包括连接子，含二硫键的多肽，Affibodies 和Knottins融合在重链和轻链的N端和C端。附加体双特异性抗体分子可进一步通过IgG融合可与配体结合的受体结构域来形成。尽管与经典的双特异性抗体不同，该分子仍然展示出两种不同的特异性。IgGs附加体:融合Fab臂在IgG上融合Fab臂，例如串联的Fab融合在Fc上用于产生四价的(Fab)2-Fc 融合蛋白，于是形成了Fd加长的重链，与轻链表达产生Tandemabs 。该形式可用于产生四价双特异性(Fab)2-Fc 融合蛋白。在这里产生双特异性分子也面临着轻链的问题，原因是存在着8种组合的可能，但只有一种是双特异性分子。Brunker 和他的同事运用CrossMab 技术产生双特异性IgG-Fab 分子，将第二个Fab以(G4S)4 连接在IgG分子上（图2-7）。在该方法中融合的Fab以VH-CL,VL-CH1的方式连接，该方法已经用于产生三价双特异性抗体，该抗体可靶向成纤维细胞活化蛋白（FAP）,用来靶向活化的肿瘤基质纤维母细胞，另一个抗原结合位点为DR5(TRAIL receptor 2) ,来通过死亡受体诱导凋亡（图2-10）。VHCL 和VLCH1 顺序上存在着差异。在VLCH1 形式中，VL结构域融合在HC的C端，与母本抗体相比，降低了对FAP的结合，而VHCL（VH融合在HC C端）形式的抗体结合活性没有改变。结合knob-into-holeFc 区，该方法也可以产生三价，双特异性IgG-Fab融合蛋白。orthogonal Fab 在上文中已描述到，可用于产生三价，双特异性Fab-IgG融合蛋白（图2-10）。在这里，外Fab臂通过Fd与重链VH相连，内Fab通过(G4S)5连接，该方法已经用于产生双特异性Fab-IgG，比如产生抗HER2的Fab-IgG，抗HER2的可来自于pertuzumab 和trastuzumab。Fab-IgG融合蛋白与scFv-IgG融合蛋白相比具有相同的特异性，但是有着更优越的生物物理特性和独特的生物学活性。Fab-IgG融合蛋白也可以将带电荷残基突变或疏水-极性交换突变引入CH1-CL。在这个研究中第一个抗体的Fd片段融合者一个铰链区（野生型或拥有两个半胱氨酸突变为丝氨酸），然后通过STPPTPSPSGG连接子连接在CH1含有CR3或MUT4突变的重链上。内Fab结合位点的同源轻链含有相应的突变。因此，分子中重链含有野生型铰链区通过两个Fd之间附加的铰链区形成的二硫键共价连接（图2-10）。双特异性Fab-IgG融合蛋白，功能上呈现三价，外部的Fab臂针对HLA-DR,内侧的Fab靶向CD5。良好的稳定性，有限的蛋白聚集，体外实验显示CD5 x HLA-DR(CR3)分子有很好的生物活性。在内部Fab含铰链区不含半胱氨酸的分子表现出一定程度的结合力减少，在某些方面，如在补体激活方面，效应功能减弱。如前文描述一样，含有TCR Cα 和 Cβ结构域的Fabs应用于和第二个Fab臂重链的N端或C端以(G4S)4相连，如前文所述源于trastuzumab 和 pertuzumab形成的双特异性抗体。在一条Fab臂中额外的突变引入VL结构域(Y36F)来减弱VH-VL相互作用，结合VL和VH之间突变引起的电荷相互作用(VL Q38D, VH Q39K)，进一步促进同源Fab臂的正确配对。前文所述DNL技术用于产生六价，双特异性IgG-Fab4分子（图2-19），该分子通过混合DDD2 Fab融合蛋白，AD2 IgG融合蛋白在氧化还原条件下，通过proteinA纯化制得。因此，该方法产生2+4分子，拥有IgG的两个结合位点识别第一个抗原。其他四个来自于Fab臂的抗原结合位点针对第二个抗原。DDD2可以融合在FabFc链的N端或者C端。进一步的AD2结构域融合在重链或者轻链的C端。在HexAbs中，AD2融合在重链CH3的C端，补体效应相对减弱，其他Fc介导的功能例如ADCC仍然保留。一些六价体抗体(bsHexAbs)，如针对CD20和CD22的六价体抗体显示出混合两种母本抗体无法达到的生物学功能，产生诱导凋亡和增殖抑制的改善。尽管其分子量达到了近~350KDa,但是与母本抗体相比，在小鼠体内，尽管组织摄取类似，但半衰期下降了2-3倍。这可能要归因于细胞内对bsHexAbs的降解。IgGs附加体：融合额外的重链和轻链可变区结构域在IgG的重链和轻链分别融合第二个特异性的可变区结构域VH和VL，产生所谓的双可变区抗体DVD-Ig(图2-12)。最初的DVD-Ig用于构建靶向IL-12和IL-18的双特异性抗体，该形式已经用于多种抗体的双特异性抗体构建，包括IL-1a和 IL-1b, HIV gp41和 gp120, CD20 和 CD47, EGFR 和 HER3, CD20 和 HLA-DR,以及HER2，CEA,DOTA的两个不同表位抗体。分析了一系列DVD-Igs ，针对TNF和另一个可替换的治疗靶点，两个结合位点的位置互换（内部，外部互换），用于重链和轻链上的连接子不同的连接长度，从5-13个氨基酸，对这些影响抗体功能因素逐一的作了研究。结果显示，当针对TNF的结合位点位于内部时，亲和力要低一些，这有可能是空间位阻的原因，导致了结合速率的降低。当两个可变区在一条链上时，连接子也影响着结合。在另一个gp41和gp120 特异性DVD-Igs研究中，结果显示内部结合位点需要至少15个氨基酸长度的连接子，而且选择螺旋型连接子，对DVD-Igs比柔性连接子更加有效。利用单粒子电子显微镜对DVD-Ig进行研究，发现其外结合位点具有高度的流动性，可以折叠出平面外，使抗原与内结合位点结合，而DVD-Ig结合IL-12和IL-18 的3D结构进一步证实了这一点。进一步对DVD-Ig技术的研究是在外部和内部VL之间引入蛋白酶酶切位点，例如金属蛋白酶酶切位点。这些可激活的DVD-Ig可以靶向外部结合位点，例如细胞表面，通过酶切，可以结合另一个抗原。该方法用于针对ICAM 和TNF的 aDVD-Ig增强了对炎症部位的特异性，减少了脱靶造成的对炎症组织的损伤。交叉双可变区结构域Ig样蛋白(CODV-Ig) 代表着另一种形式：两个VH和两个VL结构域相互连接通过交叉配对形成VH-VL结构域，它们的排列顺序可以变化（从N端到C端），以VHA-VHB和VLB-VLA或者以VHB-VHA和VLA-VLB的排列顺序排列（图2-12）。因此，无论是轻链，还是重联，可变区顺序是可以变化的，而另一条链以第一条链的顺序为模板，因此，总共会产生四种排列结构形式。由于只在CODV-Igs中生成循环的自包含结构，所以CODV-Ig格式与DVD-Ig格式不同。CODV-Ig 形式已经用于构建针对IL-4和IL-13,TNF和IL-12/23双特异性抗体。连接子(L1 to L4) 拥有不同的长度，包含alL-glycine 的连接子，通常用于连接两个可变区，以及连接内部可变区到恒定区第一个结构域。尽管连接子的长度和序列影响着产量和蛋白聚集倾向，研究发现，几乎所有经过分析的连接子都可以实现Fv和Fc的正确配对。通过抗IL-4 x抗IL13 CODV-Fab的三维结构，发现了其结合位点的紧密组装，并与抗原形成复合物。修饰的IgG分子对称的双特异性IgG分子，例如修饰的IgGs,通过修饰VH和VL结构域（2-in-1,4-in-1抗体）或者移植额外的结合位点在Fc的C端，可以识别两种不同的抗原(mAb2) 。工程化抗体可变区结构域Fv靶向多个抗原位点产生结构上不变的双特异性抗体。因为Fv区有两个可变区结构域组成（VH,VL）,因此每组VH,VL识别一种抗原，两组VH,VL可以识别不同的抗原，因此可以产生双价双特异性抗体（2-in-1抗体）（图2-18）。一种双特异性IgG针对HER2 和 VEGF ，源自含有双特异性的Fabs,该抗体的轻链来自于Herceptin (trastuzumab) ，通过随机选择暴露在溶剂中的VL CDR位点的子集来模拟氨基酸组成和长度的自然多样性。通过进一步筛选和亲和力成熟，产生多种IgGs可以在（nM）浓度下结合HER2 和VEGF 。晶体结构显示，尽管在广泛重叠的部位，Fab无论是和HER2,还是VEGF，都有很好地结合。体外实验显示2-in-1结构双特异性抗体对两种抗原有很好的中和作用，进一步的研究表明，在不增加熵代价的情况下，抗原结合位点的结构可塑性增强。这种方法随后应用到优化HER1 x HER3 ，IL-4 x IL-5 2-in-1双特异性抗体 IL-4 x IL-5 2-in-1双特异性抗体中。HER1 x HER3 2-in-1 双特异性抗体 HER3 2-in-1 双特异性抗体增价了对受体的中和作用，有望克服对HER2抑制和放射耐受的作用。这一抗体MEHD7945A 已进入临床1，2期试验。研究表明，该药有很好的药效，明显的抗鳞状细胞癌和头颈癌的作用。在2-in-1，形式中，6个互补决定区（CDRs）通过修饰，识别两种，因此会产生重合的抗体表位。另一种方式是利用DutaMab 和DutaFab 形式（图2-18）.在该模型中，抗体结合部位6个CDRs,限定3个组成Fv的抗原结合部位。CDRs的H1,H3和L2结合一种抗原，CDRs的L1,L3和H2结合另一种抗原。两组由3个CDRs组成的Fv朝向不同。因此，只要两种抗原在大小和形态上互不干扰，DutaFabs 和DutaMabs 一个Fab臂可以就同时结合两种不同的抗原（或者在一个IgG里识别两种不同的抗原对）。除了可变区结构域中的CDR loop环，其它暴露于表面的loop结构也可以用来产生人工的结合位点。这一方法已经成功地用于IgG1 Fc区。最初，在CH3区域的c端随机选取两个环状序列进行抗原结合，如HER2所示，产生Fc片段(Fcab)具有纳米级亲和力。更重要的是随机化的片段并没有影响与ProteinA以及CD64的结合.Fcab 片段的稳定性，进一步的通过工程化引入链内二硫键和直接的酵母展示进化得到提高。CH3结构域的三个loop环(AB, CD, EF) 可以供随机化选择。通过Fcab 建立第二个抑制性Fab臂，产生双特异性IgG分子(mAb2) ，该结构保持了所有IgG的特性，包括半衰期及生产制备（图2-18）。基于对称Fc和CH3的双特异性抗体自然抗体，Fc的主要作用是形成同源二聚化模块，而且还介导相应的效应功能，如ADCC,细胞吞噬，补体固定。运用Fc区，通常进一步包括铰链区形成二硫键共价连接，双特异性抗体可以通过在抗原结合部位的N端融合另一半双特异性模块，或者在N端和C端融合抗原结合位点，例如scFv，产生四价双特异性抗体。该方法应用于针对 TNF和荧光素异硫氰酸酯(FITC)的两个scFvs的概念验证研究。第一个scFv (anti-TNF) 融合在含有铰链区修饰的IgG1的Fc上，第二个scFv (anti-FITC) ，连接在Fc的C端，在第二个scFv的连接过程中，对不同的连接子进行了测试，包括(G4S)3AAA 连接子, A4T连接子 (T(A4T)3AAA), 和一个 CL 连接子 (EGKSSGASGESKVDAAA) （图2-13）。所有的三个连接子都可以形成双靶向分子，类似于scFv-Fc-scFv 融合蛋白的稳定性。A4T 连接子随后用于产生针对IT1和CXCL13scFv-Fc-scFv 融合蛋白。该蛋白显示单克隆抗体样特性，比如产量，稳定性以及粘度。该方法进一步用于产生针对LPS和EGFR的三价双特异性抗体，该双特异性抗体运用了二硫键稳定化的scFv经G4S连接子连接在Fc上。在另一个方法中,scFv分子串联排列，每一个scFv形成单独的折叠和结合单元，融合在Fc上。例如四价，针对CD2不同抗原表位的scFv串联产生双特异性taFv-Fc 融合蛋白，可诱导处于静止期的T细胞进入有丝分裂增殖。一个24氨基酸的螺旋连接子用于连接两个scFv部分。taFv-Fc 形式也可以用于产生四价双特异性Fc融合蛋白。例如针对C5和cotinine 的四价双特异性Fc融合蛋白用于免疫印迹和免疫沉淀实验，该结构两个scFv通过(G3S)3 连接子链接，串联的scFv融合在IgG1 Fc的铰链区。与可替宁结合的scFv在此充当共轭可替宁的识别模块，例如，辣根过氧化物酶(HRP)。在另一项研究中，靶向HER2和cotinine的taFv-Fc 融合蛋白可用于ELISA和放射免疫检测。通过用HRP-cotinine 或125I-cotinine 偶联的组氨酸二肽，用于her2阳性肿瘤 her2阳性肿瘤的单光子发射CT成像。其他的taFv-Fc 融合蛋白包括针对TAG-72和 MUC1 或 EGFR 和HER2 ，用于双靶向肿瘤相关抗原。其它用途包括T细胞重定向（例如针对GD2和CD3 ），以及靶点依赖的聚集和激活死亡受体，例如taFv-Fc 融合蛋白识别DR5和黑色素瘤相关的硫酸软骨素蛋白多糖。取代融合两个scFv到Fc的N端，也可以融合一个Fab臂到scFv-Fc上（图2-13），构成Fab-scFv-Fc 融合蛋白。Fab-scFv-Fc 融合到哪白表达需要表达四条多肽连，一条编辑FdscFv-Fc 部分，一条编辑轻链。该形式已经用于产生四价双特异性抗体(BiS4aPa) 靶项两种来自于假单胞菌不同的胞外多糖抗原(PcrV 和Psl) ，或者用来治疗假单胞菌感染。该抗体重scFv插入到上游铰链区C220 和 D221 之间，以10个氨基酸的连接子G4SG4S 连接。该抗体药(MEDI3902) 已进入临床2期(EVADE, NCT02696902) ，主要目的是预防机械通气设备引起的院内感染肺炎。双特异性diabody格式用于生成Fc融合蛋白，方法是将其中一条diabody链与共价连接的CH3结构域或Fc链融合（图2-13,14）。这将产生所谓的Di-Diabodies ，该结构是四价的，双特异性分子构成了两条链，一条VLB-VHA CH3 或 VLB-VHA-Fc 链，与第二条链VLA-VHB 共表达。该方法已经用于产生针对EGFR 和IGF-1R.的Di-Diabody ，尽管Di-Diabody 在结合力上显示了双受体中和活性，体外试验显示，结合力有所减弱，这可能主要归因于两条链在循环中发生解离。scDb 有着显著地稳定性，这要归因于双特异性diabody 四个可变区的共价连接。在Fc上融合一个scDb 产生三价的双特异性分子，在分子量，药代动力学性质上都和IgG类似。上文提到的Fcab 形式可用于产生scFv-Fcab 融合蛋白，由一条链编码（图2-13）。在Fc的C端有两个抗原结合位点，而且Fc的N端融合这两个scFv形式的额外抗原结合位点。这一形式已经用于产HER2,CD3双特异性抗体，scFv结合与CD3,在体外实验和动物模型上都看到了T细胞重定向的肿瘤细胞杀伤效应。源于免疫球蛋白衍生物结构域同源二聚化的双特异性抗体多种多样的免疫球蛋白结构域形成同源二聚体，例如IgG,IgA,IgD中的CH3,IgM,IgE中的CH4。此外，在IgM,IgE中的CH2起着铰链区的作用，将Fab臂与CH3,CH4相连。与IgG,IgA,IgD不同的是，IgM,IgE中的CH2通过1-2个二硫键共价连接，而且存在额外的N-连接糖基化位点。这些结构域可用于锚定产生四价双特异性分子（图2-14，15）例如，在IgM,IgE CH2的N端和C端融合scFv或一个diabody ，也可以在CH2 N端融合一个单链diabody(scDb-CH3) 。表3.双特异性抗体临床研究进展双特异性抗体产业化展望双特异性抗体形式如图2所示，阐述了近100多种不同的形式，是我们目前已知晓的双抗及其衍生物构建形式。本文旨在囊括截止2016年9月，文献中描述的所有概念上不同的经过实验验证的格式，但是不得不承认我们忽略了有些结构形式。抗体由不同的结构域组成，这些组成部分中部分模块互换就可以构成不同的形式。因此，将有更多的形式及衍生物创造出来，有一些已经被创造了出来。形式上巨大的多样性导致了一个问题：我们真的需要这么多的形式吗，如果是，为什么？这么多可用的结构形式一个很大的原因是这种模块化构造的结构域多样性强大的组装潜力。在很多案例中，这些模块化的结构域就像搭积木一样，不同的搭建方式产生千变万化的结构。因此，因此，抗体工程一直是一个有趣的领域，值得研究人员在生物制药行业，以及学术和政府机构设置。经过20多年的发展，只要遵循特定的法则，现在几乎可以保证成功。可用的(或不可用的)自由操作(FTO)或知识产权(IP)空间、对某些格式的限制以及保护自身开发的愿望可能是双特异性抗体格式爆炸的额外驱动因素。这些因素和其他因素最初导致了对这种多样性必要性的一些怀疑。“格式动物园”如今已被相当多的设计师等同于游乐场。我们承认，动物园和游乐场对许多年轻、活跃、开放和探索的人类有相似的吸引力，我们不认为这是坏事!与此同时，现实表明，拥有多样性的形式不仅是设计师智慧的表现，而是双特异性抗体疗法进展必要的和一个关键的驱动因素。越来越多的基因工程双特异性抗体目前正处于临床发展阶段，有些已进入晚期有些已经可以作为药物使用(表3)。这些双特异性抗体表现出非常不同的形式，有些是大的，包含恒定区域，有些是小的，没有恒定区域。事实上，大多数主要形式的簇都是由一个或多个已进入临床的分子组成的。很明显，即使没有FTO或IP限制或竞争/战略挑战，“一刀切”不能应用于过多的含有期望功能和双特异性抗体的应用。格式多样性是双特异性抗体应用所需的由于需要产生的双特异性抗体的多样性和所需特性的可变性，因此不可能有‘一种最佳格式’用于大多数所需的分子组合。不同的靶点产物索要达到的预期疗效（对产物功能和行为的界定）需要多种形式的分子构造，这包括在分子大小，排列顺序，价位，灵活性，几何学构造等方面都要考虑最终产物与结合分子的结合，同时要考虑药物的最终分布以及药代动力学。为了实现双特异性，需要考虑的因素包括不同靶抗原的特殊排列或大小，在某些情况下，还要考虑把抗原在细胞表面的密度。这决定了哪些形式可以同时或相互排斥地实现二价、三价或多价与一个或两个抗原的结合。小的格式变化，如链接长度或结构的微小变化或域的“切换”，可能是功能的关键决定因素。一些设计参数可以从结构模型中推导出来。然而，在许多情况下，必须通过生成和比较不同格式的功能来确定合适的格式。分布和药代动力学行为是直接受双特异性抗体格式选择影响的其他重要参数。在需要较长的半衰期时，分子结构设计需要＞50KDa 以避免被肾脏清除，以及其它方面的设计确保抗体可以通过FcRn介导的再循环。FcRn介导的再循环是包含Fc双特异性抗体的基本特征（确保FcRn结合位点不能有突变）。另一种策略是引入血清白蛋白以增加FcRn介导的再循环。小分子量双特异性抗体用于哪些需要快速起效，快速分布的需要。或者希望严格控制其水平，以选择快速降低水平。鉴别具有预期功能的双特异性抗体只是药物开发的第一步尽管格式多样性是双特异性抗体用于不同功能的先决条件，我们想要强调的是，在现实生活中，并不是所有的动物园成员都是可以轻易处理的。有些看起来不错，但实际上表现很差。为了药物开发，分子和格式需要以可重复的方式大量生产，最好是用已建立的或类似的方法以高产量生产。组成结构越复杂，经常需要对表达式系统进行更广泛的优化。必须特别指出的是表达体系的稳定性和产量并不是唯一需要考虑的因素。事实上，双特异性抗体的组成和不需要的副产物的存在或不存在具有同等(或更高)的重要性。除了适用于生产和上下游加工外，双特异性抗体还需要定义明确、稳定和整体“表现良好”才能成为药物。这些参数中的许多都是在术语“可开发性”下讨论的。满足可开发性标准的双特异性抗体将是稳定的(例如，针对热变性)，具有较低的聚集倾向、较低的积累化学偏差的倾向，并且(取决于应用方式)优先能够在高浓度下配制而不存在粘度问题。因此，设计、优化和表征具有预期特异性和功能性的双特异性抗体只是一个漫长过程的开始。将这些分子转化为药物是一项艰巨的任务。然而，这部分是关键，没有这部分，双特异性抗体就只能是动物园里的外来成员，而不是药物。